华农团队揭示RNA聚合酶在调控铜绿假单胞菌群体感应与社会行为中的意外作用

要理解细菌种群的功能与进化，必须鉴定具有社会意义的亚群，包括此前未被发现的新型欺骗者。本研究揭示了RNA聚合酶（RNAP）在调控铜绿假单胞菌群体感应（QS）及QS相关社会行为中的意外作用。具体而言，我们证实RNAP α亚基（RpoA）是该过程中的关键调控组分。RpoA C-端结构域内的一个单核苷酸突变可改变QS活性，驱动细菌依环境不同在合作表型与欺骗表型之间转换。这一新型非经典QS欺骗者突变体的发现，为种群内互作、种群稳定性与进化动态提供了新见解。这些发现对微生物生态学具有重要意义，并深化了对细菌群落社会进化的理解。

关键词

群体感应、核糖聚合酶、RpoA、铜绿假单胞菌、实验性进化、细菌通讯

介绍

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性机会致病菌，可在人体引发严重且危及生命的感染，如囊性纤维化（CF），尤其多见于免疫功能低下人群。该病原菌以社会性群落形式生存，表现出复杂的社会行为，包括细胞间的通讯、合作与竞争。突变亚群间的互作显著影响种群整体行为，调控毒力因子合成、生物膜形成、耐药性发展以及微生物-宿主互作动态。因此，鉴定并解析具有社会功能的变异亚群，对于理解微生物群落的社会结构与进化动态至关重要。然而，许多铜绿假单胞菌突变体的社会性状仍知之甚少。这一认知不足阻碍了对铜绿假单胞菌社会进化的理解，也制约了针对该菌感染的有效治疗策略研发。

铜绿假单胞菌通过一种被称为群体感应（QS）的细胞间通讯系统协调群体行为，该系统通过合成与感知小分子信号分子，以细胞密度依赖的方式调控种群基因表达。该病原菌拥有复杂的层级式QS网络，主要由三大系统构成：Las、Rhl和PQS。Las与Rhl系统各包含一对合成酶-受体蛋白，即LasI/LasR与RhlI/RhlR，分别合成并响应酰基高丝氨酸内酯（AHL）信号分子N-3-氧代-十二烷酰基-高丝氨酸内酯（3OC12-HSL）与N-丁酰基-高丝氨酸内酯（C4-HSL）。这些AHL分子结合其对应的转录调控因子LasR与RhlR，激活转录应答，调控大量与毒力、生物膜发育及代谢适应相关的基因。第三大系统通过pqsABCDE操纵子发挥作用，该操纵子编码合成喹诺酮信号分子2-庚基-3-羟基-4(1H)-喹诺酮（铜绿假单胞菌喹诺酮信号，PQS）的酶。该分子与转录调控因子PqsR（MvfR）结合，触发正反馈环路，进一步放大PQS合成。该操纵子编码的关键蛋白为PqsE，一种金属β-内酰胺酶。除参与喹诺酮合成外，PqsE可与RhlR发生物理互作，稳定该受体并增强其与靶启动子的亲和力。这一互作对RhlR发挥最大活性至关重要，经典C4-HSL信号与PqsE结合共同介导RhlR依赖型毒力因子的充分表达。在该QS层级中，Las QS系统通常被视为主调控因子，位于调控网络顶端，控制Rhl与PQS系统的表达。

实验进化研究证实，QS社会欺骗者突变体可从野生型（WT）铜绿假单胞菌种群中出现。值得注意的是，携带关键QS调控基因lasR与pqsR突变的个体被鉴定为社会欺骗者，可利用亲代种群的合作行为获益。在相似体外条件下，未观察到野生型菌株进化出RhlR突变体。LasR突变体的社会欺骗行为在小鼠感染模型中得到进一步验证，且这类突变体也频繁从急性与慢性感染阶段的CF患者中分离得到。这些发现提示，QS缺陷突变体（尤其是LasR突变体）可在社会进化压力塑造的临床环境中被正向选择。与之相对，临床分离的铜绿假单胞菌通常呈现高度多样化的突变亚群，这是由感染环境复杂且动态的选择压力所塑造。在这些多样化的临床种群中，很可能存在此前未被发现、与QS相关的新型社会功能变异体。解析这些突变体并阐明其在铜绿假单胞菌社会与致病格局中的作用，可为感染动态提供关键见解，并为新型治疗策略研发提供依据。

细菌RNA聚合酶（RNAP）负责合成RNA，在基因转录调控中发挥关键作用。RNAP是多亚基酶，核心亚基包括α、β、β′与ω。为启动启动子特异性转录，RNAP核心酶与σ因子结合形成全酶，识别靶DNA序列。在这些亚基中，rpoA编码的α亚基形成二聚体，为β亚基组装提供支架，并参与启动子识别。从结构上看，α亚基（RpoA）包含N端结构域（α-NTD）与C端结构域（α-CTD），由一段短连接区相连。α-NTD对RNAP组装至关重要，而α-CTD介导与转录调控因子的互作，并结合启动子上游富含AT的序列。RpoA是细菌存活必需蛋白，在多种细菌中高度保守。传统观点认为，RNAP亚基基因突变属于次级适应性改变。值得注意的是，rpoA突变可补偿利福平耐药带来的适合度代价，促进病原体传播。我们近期的研究拓展了对RpoA生物学功能的认知。我们鉴定出一种RpoA突变体（T262→A，命名为RpoA262），可通过下调MexEF-OprN外排泵基因表达，恢复LasR完全缺失株的QS活性。该RpoA突变体对MexEF-OprN外排泵底物类抗生素的敏感性也显著升高。

图4 RpoA289突变体相较野生型菌株具有竞争优势。

（A）各菌株在酪蛋白培养基中的纯培养生长情况。培养18小时后拍摄试管照片。

（B-D）RpoA289突变体与野生型PAO1菌株的竞争适合度。

（B）在酪蛋白培养基中以90:10（突变体:野生型）比例起始共培养，24小时后通过脱脂奶琼脂平板计数细菌种群。

（C）RpoA289 突变体随时间的相对频率变化。

（D）指定时间点共培养物的代表性图像。实验设置三次独立生物学重复，每项重复至少进行三次技术重复，结果一致。

为发现新型QS缺陷型欺骗者突变体，我们近期采用了“靶向基因复制后突变体筛选”（TGD-MS）策略。利用该方法，我们鉴定出GroEL突变体为非LasR型QS欺骗者（见随附手稿）。本研究中，我们迭代应用TGD-MS策略，在铜绿假单胞菌PAO1中额外导入lasR与groEL拷贝并进行实验进化。最终发现一种新型RpoA突变体（L289→S，下称RpoA289），可影响QS调控的蛋白水解过程。与增强QS的RpoA262突变体相反，RpoA289突变体呈现QS缺陷表型，包括QS调控基因转录降低、信号分子合成减少。此外，该RpoA289突变体在哺乳动物宿主细胞中毒力减弱，这可能源于QS控制的毒力因子合成下降。从功能上看，QS缺陷型RpoA289突变体表现为社会欺骗者，通过利用QS正常细胞产生的公共物品获得适合度优势。结构模拟显示，该RpoA突变体改变α-CTD的三维构象，降低RNAP与QS基因启动子（lasI、lasR）的结合亲和力，进而调控QS活性。此外，我们发现rpoA突变在天然铜绿假单胞菌临床株中普遍存在，这类变异体呈现多样化的QS调控效应。基于上述结果，我们提出：α-CTD内存在两个拓扑上相互独立的功能决定位点，可介导对QS的相反调控效应。

综上，本研究证实迭代式TGD-MS策略可有效发现复杂通路中隐藏的调控组分。我们揭示了RpoA在QS调控中的双重作用，拓展了其已知生物学功能。此外，我们证实rpoA突变可驱动细菌种群产生不同社会行为，实现合作与欺骗策略之间的转换。