可抑制生物膜！石河子大学团队发表新型耐药菌噬菌体

2026 年 1 月，上海探普生物客户石河子大学 万生辉 等学者在《BMC Microbiology》发表了题为《Multidimensional characterization of a novel porcine Klebsiella pneumoniae phage Pkp-1》的文章，该研究从分离纯化、生物学特性、抑菌与生物膜清除能力、全基因组及进化分析等维度，系统解析了一株靶向猪源多重耐药肺炎克雷伯菌的新型裂解性噬菌体 Pkp-1。研究发现：1）Pkp-1 属于有尾噬菌体纲凯夫病毒属，为短尾裂解性噬菌体；2）具备极优侵染效率，最佳 MOI 低至 0.00001，潜伏期 25 min，裂解量 108 PFU/cell；3）环境适应性强，40–60 ℃、pH 4.0–11.0 保持高活性；4）可高效抑制浮游菌、清除 / 抑制生物膜，最高抑制率达 90.83%；5）基因组无耐药、毒力及溶原基因，存在 19 次重组事件，尾蛋白基因发生特异性重组进化；6）宿主谱极窄，仅裂解猪源 ST967 型肺炎克雷伯菌。研究为防控猪源多重耐药肺炎克雷伯菌感染提供了新型候选生物制剂，也为噬菌体适应性进化机制提供了新依据。

研究背景

肺炎克雷伯菌是重要的人兽共患机会致病菌，可引发猪化脓性纤维素性肺炎、乳腺炎、败血症，也可导致人类尿路感染、肺炎、肝脓肿甚至败血症。近年来抗生素滥用导致多重耐药肺炎克雷伯菌（MDR-Kp） 广泛流行，碳青霉烯耐药、超广谱 β- 内酰胺酶耐药菌株不断出现，临床与畜禽养殖端治疗难度急剧上升，亟需抗生素替代方案。

噬菌体作为细菌病毒，具备宿主特异性强、不易诱导耐药、环境友好等优势，是应对多重耐药菌的理想备选。但当前针对猪源 MDR-Kp的噬菌体研究较少，兼具高裂解活性、强环境稳定性、生物膜清除能力且安全性高的噬菌体资源匮乏。同时，噬菌体宿主识别关键的尾蛋白进化与重组机制尚不清晰，限制了噬菌体制剂的开发与应用。

研究方法

1、菌株与样品来源

宿主菌：新疆五家渠市猪场分离的多重耐药肺炎克雷伯菌 KP-02（对 7 类 15 种抗菌药物耐药）。

宿主谱检测：117 株菌株（100 株肺炎克雷伯菌、10 株大肠杆菌、7 株奇异变形杆菌）。

噬菌体分离样品：新疆规模化猪场粪便与污水。

2、噬菌体分离与纯化

富集培养：以 KP-02 为宿主，对粪便 / 污水样品进行噬菌体富集。

分离纯化：点滴法初筛，双层琼脂法纯化 3–5 轮至噬斑形态均一。

浓缩与电镜：PEG 沉淀浓缩噬菌体，透射电镜观察形态。

3、生物学特性测定

宿主谱、最佳 MOI、一步生长曲线、热稳定性（40–80 ℃）、pH 耐受性（pH 1.0–14.0）。

抑菌试验：检测不同 MOI 对浮游菌的抑制效果。

生物膜试验：结晶紫染色法检测生物膜抑制与清除能力。

4、基因组与生物信息学分析

全基因组测序：Illumina NovaSeq 6000 平台，SPAdes 与 SOAPdenovo2 组装。

功能注释：GeneMarkS 预测 ORF，CARD、VirulenceFinder 检测耐药与毒力基因。

进化与重组分析：ViPTree 构建进化树，RDP4.0 检测重组事件，ESPript 3.0 比对尾蛋白序列。

研究结果

01

噬菌体分离与形态：

短尾凯夫病毒属新型重组嵌合体

从猪场污水 / 粪便中成功分离裂解性噬菌体vB_KpnA_Pkp-1（Pkp-1）。

噬斑：中心清晰、周围半透明晕圈，具备解聚酶活性。

电镜：二十面体头部（62±2 nm），短尾（17±1 nm），属于有尾噬菌体纲凯夫病毒属。

分类：基因组存在 19 次重组事件，为新型重组嵌合体噬菌体。

图2：噬菌体Pkp-1的透射电子显微照片

02

宿主范围：

严格特异性裂解猪源 ST967 型菌株

Pkp-1 宿主谱极窄，仅对猪源 ST967 型（wzi19-KL19-K19） 肺炎克雷伯菌具有裂解活性（裂解率 36.7%）。

对牛、禽、羊源肺炎克雷伯菌无裂解作用。

对大肠杆菌、奇异变形杆菌无交叉裂解，靶向性极强。

03

侵染增殖与环境稳定性

最佳 MOI：0.00001（远低于多数克雷伯菌噬菌体，极少病毒粒子即可高效侵染）。

潜伏期：25 min，增殖快速。

裂解量：108 PFU/cell，裂解能力突出。

热稳定性：40–60 ℃活性基本不变；70–80 ℃快速失活。

pH 耐受性：pH 4.0–11.0保持高裂解活性；强酸（≤3.0）、强碱（≥12.0）完全失活。

满足畜禽环境应用与制剂加工的稳定性要求。

图3：噬菌体Pkp-1的生物学特性

04

抑菌与生物膜调控：

高效清除浮游菌与生物膜

浮游菌抑制：6 h 内完全抑制 KP-02 生长，12 h 内仍显著抑制（P<0.05），效果呈浓度依赖性。

生物膜抑制：MOI=0.1 时抑制率最高，12 h 生物膜减少 90.83%。

成熟生物膜清除：可显著破坏已形成的生物膜，生物量显著下降（P<0.05）。

图5：噬菌体Pkp-1可抑制肺炎克雷伯菌KP-02的生物膜形成，并破坏已形成的生物膜。

05

基因组特征：

安全无风险，尾蛋白发生特异性进化

基因组：双链 DNA，长度 38,455 bp，GC 含量 50.57%，48 个 ORF。

安全性：无耐药基因、毒力基因、溶原相关基因，临床与养殖应用安全。

功能模块：分为结构 / 包装、裂解、DNA 复制调控、代谢四大模块。

进化特征：与 phi1_146013（98.71%）、P7124（97.25%）同源性最高；尾蛋白基因存在 2 次特异性重组，与已知凯夫病毒属尾蛋白序列差异显著，决定宿主特异性适配进化。

图6：噬菌体Pkp-1的环状基因组图谱。

总结

1、资源创新

获得一株猪源 MDR-Kp 专用新型裂解噬菌体 Pkp-1，兼具高裂解、高稳定、强生物膜清除能力，且基因组安全无风险，是理想的抗生素替代生物防控剂。

2、机制突破

证实尾蛋白基因重组是噬菌体宿主谱适配的关键进化机制。

明确 Pkp-1 为凯夫病毒属新型重组嵌合体，完善了该属噬菌体的分类与进化认知。

揭示噬菌体解聚酶活性与生物膜清除的直接关联，为耐药菌生物膜防控提供新靶点。