一种检测万古霉素中度耐药金葡菌突变体的扩增子测序策略

万古霉素中度耐药金葡菌(Vancomycin Intermediate Resistance Staphylococcus aureus, VISA)的定义是万古霉素的最低抑菌浓度(MIC)值在4-8μg/mL，而万古霉素异质性中度耐药的金葡菌(heterogeneous VISA, hVISA)则是万古霉素MIC值在2-4μg/mL。在金葡菌的几个关键基因上的多个位点发现了与VISA相关的突变。VISA通过增厚细胞壁、减少自溶发生、增加荚膜以及增加四烯酸的d -丙烯烷化等手段降低细菌对万古霉素的敏感性。

  目前，VISA的检测手段主要为微量肉汤稀释法，操作繁琐且费时。基于纳米孔(Nanopore)的测序方法为检测细菌抗生素抗性提供了一个可供选择的快速检测方法。因此，在本研究中，开发了一种方法，通过对代表VISA选择中最常突变的基因的扩增子进行长读长基因组测序，加快检测金黄色葡萄球菌中复杂的多基因抗生素抗性表型万古霉素中间抗性(VISA)。

  首先，以10个扩增子作为引物，扩增产物将覆盖与VISA表型相关的16个基因。通过使用Oxford Nanopore适配器与Flongle流通池连接，对扩增子库进行了长读长测序。然后，通过其读长与亲缘共有序列或已知参考序列进行作图分析，并与假定的变体与实验室中已知VISA突变体的数据库进行比较，以检测其是否存在突变。数据库中的每个扩增子均被测序至较高的(>1000×)覆盖率，并且在扩增子长度和覆盖率之间未发现任何关系。

  此外，我们还发现了来自USA300菌株(来自亲缘菌株N384的N384-3)的VISA突变体中的致病突变(walK 646C>G)。将突变体(N384-3)和亲缘(N384)DNA以0比1突变体的各种比例混合，表明在95%置信度下平均次要等位基因频率(6.5%)的突变检测阈值(高于平均突变频率的两个标准误差)。此外，该方法既可以快速识别VISA基因型，又可以整合迄今为止已知的最全面的VISA遗传决定因素数据库，为使用来自临床样品的快速纳米孔测序直接进行金黄色葡萄球菌抗生素抗性基因型推断奠定了基础。

  参考文献

  1. Moller, A. G.; Petit, R. A., 3rd; Davis, M. H.; Read, T. D., Development of an Amplicon Nanopore Sequencing Strategy for Detection of Mutations Conferring Intermediate Resistance to Vancomycin in Staphylococcus aureus Strains. Microbiol Spectr 2023, 11 (1), e0272822.