利用无标记光学代谢成像对活细菌进行实时高分辨率代谢表征

过去我们常常只能等细菌长出来、死掉了，或者把它们打碎后，才知道它们大概发生了什么。这篇文章证明，现在可以直接盯着活细菌看，几乎实时地看到它们在药物冲击下怎么改变化学状态，也能看到生物膜里哪些地方更活跃、哪些地方更沉寂。

我们平时很容易知道一大群细菌平均长得怎么样，却很难看到单个细菌此刻处在什么代谢状态，更难连续观察它们在几秒到几分钟内如何变化。传统的组学方法很强大，但大多是把很多细菌一起测，得到的是平均结果，所以看不到单细胞差异，也很难原位、活体、实时地去看细菌，尤其是生物膜里的细菌。作者关心的正是这些缺口，因为细菌的代谢状态和它们如何应对抗生素、如何形成持留细胞、如何在生物膜中表现出耐受性密切相关。文章一开始就指出，细菌异质性本身就是抗生素耐受和功能性耐药的重要来源，而生物膜又是这种异质性的集中体现，所以如果没有能够在单细胞尺度、实时尺度上读出代谢的方法，我们对很多关键现象其实都只能看到表面。

这项把一种过去更多用于哺乳动物细胞代谢研究的技术，真正推进到了活细菌研究中。作者使用的是无标记光学代谢成像，也就是不加任何外源染料，直接利用细胞内天然存在的 NAD(P)H 和 FAD 的自发荧光信号来读出代谢状态。简单说，NAD(P)H 的还原态会发光，而 NAD+ 不会；FAD 的氧化态会发光，而 FADH2 不会。所以，如果同时看 NAD(P)H 和 FAD 的荧光强度与荧光寿命，就能近似反映细胞处于更还原还是更氧化的状态，也能间接反映代谢途径和应激状态的变化。作者真正想证明的，是这套方法能不能快到足以捕捉抗生素处理后的即时反应，细到足以区分单个细菌之间的差异，还能应用到密集复杂的生物膜中。

在方法上，这篇文章用的是多光子自发荧光显微镜，同时双通道采集 NAD(P)H 和 FAD 的强度与寿命信息。显微系统的空间分辨率大约是 390 nm，文章前面还提到这种代谢成像在总体上可以达到小于 500 nm 的空间分辨率和 1 Hz 量级的时间分辨能力。实验中常见的成像视野是 100 × 100 μm，512 × 512 像素。为了做活细菌实验，作者先优化了背景培养基信号、光漂白和培养条件，然后在 750 nm、5 mW 的双光子激发条件下进行成像。研究对象主要包括四种细菌，分别是 金黄色葡萄球菌 S. aureus、铜绿假单胞菌 P. aeruginosa、卡他莫拉菌 M. catarrhalis 和 肺炎链球菌 S. pneumoniae。其中，动态抗生素实验主要围绕 S. aureus 展开，而不同物种的浮游状态与生物膜状态比较则覆盖了这四种菌。

作者做的第一件事，是看这种方法能不能读出非常快的代谢动态。他们对 S. aureus 连续成像，在加药前先拍，随后加入处理液，再持续拍 30 分钟。为了测试一种特别强烈的扰动，他们先用了 10% 漂白液。结果非常直观，也很强烈。文章在第 3 页的图 1 和第 4 页的文字说明中写得很清楚，漂白液加入后，NAD(P)H 强度迅速下降，FAD 强度明显上升，而 NAD(P)H 和 FAD 的荧光寿命随后也一起下降。作者解释说，漂白液是强氧化剂，所以最早出现的大幅 FAD 增加，很可能代表细胞内 FADH2 被迅速氧化成 FAD。而寿命信号大约在 15 分钟左右开始明显往更低方向变化，这可能和细胞死亡、破裂、局部 pH 改变等因素共同有关。更关键的是，作者明确指出，细菌对杀菌性处理的可测反应可以快到几秒内就出现，至少在 FAD 强度这个指标上是如此。也就是说，这套方法不是只能看“半小时后死没死”，而是能看到非常早的代谢冲击。接着，作者去看单细胞异质性，也就是同一批细菌里，不同细胞到底是不是已经处在不同代谢状态。他们从同一块平板上分别挑取了两颗 S. aureus 单菌落，各自培养后成像，并对每个细菌计算四个指标，分别是 NAD(P)H 强度、FAD 强度、NAD(P)H 寿命、FAD 寿命。结果显示，两组菌之间真正达到显著差异的是 FAD 强度，而另外三个指标没有显著差异。作者据此认为，寿命类指标对比较同一物种不同菌落悬液时更稳健，而强度类指标更容易受到浓度或轻微代谢差别影响。更重要的是，无论哪一组菌，单细胞分布直方图都不是一个很窄的尖峰，而是有明显宽度，这就说明即便是同一个单菌落培养出来的悬液，单个细菌之间也已经存在代谢异质性。这个结果非常重要，因为它把我们平时口头上常说的细菌异质性，真正变成了可以直接成像和量化的东西。

文章随后把重点放到抗生素响应上，而且不只是看一种药，而是比较不同机制和不同剂量的处理。作者对单个 S. aureus 细胞进行分割和追踪，在 30 分钟内持续记录其代谢曲线。使用的处理包括 H2O 对照、1% 漂白液、35 mM clindamycin，以及 20× penicillin-streptomycin。这几种处理机制并不一样。Clindamycin 抑制蛋白合成，penicillin 影响细胞壁合成，streptomycin 也影响蛋白合成，而漂白液则更像直接打乱氧化还原平衡并破坏蛋白。结果显示，每种处理都会留下不同的代谢轨迹。文章第 4 页和第 5 页的图 3 最能说明这一点。对 clindamycin 和 penicillin-streptomycin 来说，作者看到的共同模式是，药物加入后 NAD(P)H 和 FAD 强度都会先立即下降，像是细胞代谢被瞬间踩了一脚刹车，然后在大约 60 秒 这个时间尺度上出现一定恢复。作者还做了 clindamycin 的不同剂量实验，发现这种最早期的强度下跌在低剂量时会变弱甚至消失，所以他们认为，这个早期下跌本身就是细胞感受到药物代谢压力的特征之一。换句话说，这套方法不仅能看出细菌有没有反应，还能区分反应强弱和作用机制差异。

文章里还有一个实际但容易被忽略的点，就是这套系统不只是会拍图，还真能做到一定程度的单细胞计数和分割。作者专门测试了不同浓度下的 S. aureus，并用传统平板菌落计数做地面真值对照。结果表明，利用 FAD 通道做分割时，这种无标记非线性光学成像在细菌浓度最高达到 6 × 10⁸ CFU/mL 时，仍然可以做到比较准确的单细胞分辨和计数。这个结果的意义在于，作者的方法不是只能“看个大概亮不亮”，而是真能把单个细菌从背景中找出来，并进一步给每个细菌分配代谢参数。

接下来，作者把问题推进到生物膜。对 S. aureus 生物膜 做大视野拼接成像后，作者发现生物膜内部并不是均匀一层，而是存在很多大小不一的高自发荧光区域，小的约 1 μm，大的可以超过 20 μm。这些区域同时还伴随更强的 CARS 信号，说明那里脂质和蛋白的存在也更丰富。作者据此认为，生物膜内部确实存在明显的局部高代谢活性口袋，而不是所有区域代谢都一样。换句话说，生物膜并不是一个平均化的大毯子，而更像一个代谢上高度不均匀的景观，其中有些地方更活跃，有些地方更沉寂。

为了更系统比较浮游细菌和生物膜细菌，作者引入了一个常用指标，也就是 光学氧化还原比 ORR，定义为 FAD 强度除以 FAD 和 NAD(P)H 强度之和。这个值越高，通常意味着细胞相对更偏向氧化状态。作者比较了四种细菌在浮游状态和生物膜状态下的 ORR。结果显示，四种菌在生物膜中都表现出更氧化的代谢状态，但幅度不同。变化最明显的是两种革兰阴性菌 P. aeruginosa 和 M. catarrhalis，它们在生物膜中的 NAD(P)H 强度非常低，ORR 很高，说明代谢状态相比浮游时明显转向更氧化。S. aureus 和 S. pneumoniae 这两种革兰阳性菌也有类似趋势，只是没有前两者那么剧烈。作者还注意到，生物膜中的 CARS 光谱也向更低波数方向偏移，提示蛋白和脂质相关成分更多，这很可能和细胞外基质增加有关。整体上，这部分结果说明生物膜细菌和浮游细菌不仅空间组织不同，连最基本的代谢状态都系统性改变了。

所以，这篇文章的主要结果可以概括成几层很清楚的逻辑。作者证明了，无标记光学代谢成像可以在单细胞分辨率下，对活细菌进行实时代谢观察，而且能快到捕捉几秒到几分钟的变化。S. aureus 在漂白液和不同抗生素作用下，会表现出不同的 NAD(P)H 和 FAD 强度及寿命轨迹，说明这种方法对药物剂量和机制都敏感。单菌落悬液内部本身就存在明显的单细胞代谢异质性。进入生物膜之后，细菌代谢状态会整体偏向更氧化，而且生物膜内部不是均匀的，而是含有局部代谢更活跃的区域。更重要的是，这种方法不需要染色、不需要裂解、不需要培养结束后再做破坏性分析，因此特别适合看活细菌在原位环境中的真实状态。

结论

基于 NAD(P)H 和 FAD 的多光子无标记光学代谢成像，可以对细菌进行快速、高分辨率、非破坏性的代谢表征，并且能够在单细胞尺度上分析异质性，在生物膜尺度上分析空间代谢差异。这种方法提供的是一种表型层面的读出，不能替代基因型分析，但可以和基因型分析形成互补。它特别适合用来观察抗生素反应、活体微生物状态、生物膜代谢和潜在的不可培养但仍存活细胞。作者最后还明确提出，未来这种方法有潜力用于更复杂的活体环境，甚至可能走向体内微生物群落的实时研究。

今后研究细菌时，不能只满足于群体平均值，因为很多真正决定抗生素耐受、生物膜稳定性和持留状态的关键差异，往往就藏在单细胞层面和微尺度空间层面。更进一步说，这篇文章也提示，未来的细菌表征方法不一定都要依赖破坏性检测或者标记分子。像这种无标记、活体、实时的表型成像，特别适合用来研究短时间动态、生物膜内部分工以及那些难培养、难追踪但在疾病中很重要的细菌状态。接下来一个很有前景的方向，是把这种代谢成像和转录组、基因标记、抗生素敏感性测试乃至体内成像结合起来，真正把细菌的基因型、表型和空间位置同时连起来看