无需培养、无需洗涤！日本团队开发"活菌专属"检测技术，1小时内精准识别活性大肠杆菌

食品安全检测技术迎来新的突破。近日，日本东京农工大学（Tokyo University of Agriculture and Technology）联合龟甲万株式会社（Kikkoman Corporation）研究团队在国际顶级传感器期刊《Biosensors and Bioelectronics》发表最新研究，提出一种名为PULSERAA（Proximity-Unlocked Luminescence by Sequential Enzymatic Reactions from Antibody and Antibody/Aptamer）的新型均相发光检测平台。该技术能够无需培养、无需洗涤或分离步骤，仅通过混合试剂即可快速检测活性大肠杆菌（Escherichia coli），还能有效区分活菌与死菌，为食品安全监测、公共卫生防控和现场即时检测（POCT）提供了新的技术路线。

为什么检测"活菌"比检测细菌更重要？

在食品安全检测中，大肠杆菌不仅是重要的食源性致病菌，也是饮用水和环境卫生的重要污染指示菌。其中，部分致病性大肠杆菌仅需10～100 CFU即可引发感染，因此，快速判断食品或环境中是否存在具有感染能力的活菌至关重要。然而，目前广泛使用的检测方法仍存在明显局限。传统培养法虽然能够判断细菌是否存活，但通常需要2～3天才能获得结果；PCR和qPCR检测速度较快，却无法区分活菌和死菌，容易导致风险高估；ELISA等免疫检测虽然具有较好的灵敏度，但需要多次洗涤、孵育等复杂操作，不利于现场快速检测。如何实现快速、简单且能够准确识别活菌，一直是食品安全检测领域的重要挑战。

两种抗体"协同发光"，只有活菌存在才会亮

针对这一难题，研究团队设计了一种全新的检测策略——PULSERAA平台。该系统分别利用两种识别大肠杆菌不同表面抗原的抗体，一种连接葡萄糖氧化酶（GOx），另一种连接辣根过氧化物酶（HRP）。当两种抗体同时结合到同一活菌表面的脂多糖（LPS）和外膜蛋白OmpC时，两种酶被拉近至纳米尺度距离，从而触发连续酶促反应，最终产生化学发光信号。如果样品中不存在目标细菌，或者细菌已经死亡、细胞结构遭到破坏，两种酶便无法靠近，也不会产生发光信号。这种"只有靠近才发光"的设计，从根本上避免了传统方法容易检测到死菌残骸的问题。

无需洗涤、一步混合，检测流程更加简单

与传统免疫分析不同，PULSERAA采用的是**均相检测（Homogeneous Detection）**模式。整个检测过程中，研究人员只需将抗体-酶复合物与待测样品直接混合，随后加入底物即可完成检测，无需磁珠分离、离心、洗涤等繁琐操作，大幅降低了实验复杂度，也更加适合现场快速检测和自动化分析。为了实现这一设计，研究团队利用SpyTag/SpyCatcher蛋白偶联系统，将单链抗体（scFv）与葡萄糖氧化酶稳定连接，既保证了抗体的识别能力，又保持了酶活性，为整个检测平台提供了可靠的生物识别元件。

最低可检测不足2个细菌，1小时内即可完成分析

性能测试结果显示，该检测平台具有较高的灵敏度。实验中，PULSERAA对大肠杆菌浓度呈现良好的剂量依赖关系，在1～10⁴ CFU/mL范围内能够实现稳定定量检测，化学发光信号与细菌浓度呈近似线性关系。综合多次独立实验结果，其检测限（LOD）约为1.7～32 CFU/mL，能够满足食品安全和环境监测中低浓度细菌检测需求。与此同时，整个检测过程最快可在1小时以内完成，相较传统培养检测节省了大量时间，也避免了核酸扩增等复杂操作。

真正实现活菌与死菌的精准区分

相比灵敏度，更值得关注的是该技术在活菌识别能力上的突破。研究团队分别对活菌、60℃热处理细菌、90℃热处理细菌以及乙醇灭活细菌进行了检测。结果发现，仅有完整存活的大肠杆菌能够产生明显的化学发光信号，而经过加热或酒精处理后的死菌几乎不产生检测信号。研究人员认为，这是因为活菌完整的细胞膜能够维持脂多糖和外膜蛋白的天然空间排列，使两种酶能够靠近并完成连续反应；而死菌细胞膜遭到破坏，表面抗原密度下降，两种酶无法形成有效协同，因此不会产生明显信号。这一特性意味着，该方法能够更加真实地反映食品中的实际感染风险，为食品安全风险评估提供更加可靠的数据支持。

图1 PULSERAA系统的检测沙门氏菌示意图^[1]

牛奶样品验证成功，食品检测应用前景广阔

为了验证实际应用能力，研究团队进一步将该方法应用于商业牛奶样品检测。实验结果表明，在99%牛奶基质中，即使受到乳蛋白等复杂成分影响，系统仍能够清晰区分是否存在大肠杆菌，说明该检测平台具有良好的食品基质适应能力，为乳制品质量控制提供了重要参考。此外，研究人员还利用改造后的LPS缺陷型大肠杆菌以及蜡样芽孢杆菌等非目标菌进行了验证，均未观察到明显发光信号，进一步证明该平台具有较高的检测特异性。

未来有望打造便携式食品安全检测设备

研究团队表示，由于PULSERAA最终输出的是化学发光信号，因此未来不仅可以结合实验室发光检测仪，还能够与ATP生物发光仪、便携式检测设备甚至智能手机成像系统相结合，实现真正意义上的现场即时检测（POCT）。未来，该平台还可进一步拓展至沙门氏菌、李斯特菌等其他食源性致病菌检测，并应用于食品加工、环境监测、公共卫生以及医疗诊断等多个领域，为构建更加智能、高效的食品安全监测体系提供新的技术支撑。

总结

近年来，食品安全检测正从"检测有没有细菌"逐渐转向"检测是否存在具有感染风险的活菌"。此次日本研究团队提出的PULSERAA平台，通过创新性的抗体-酶协同发光机制，成功实现了快速、一步法、无需洗涤、可区分活菌与死菌的大肠杆菌检测，在保证检测灵敏度的同时，大幅提升了现场检测的便利性，为下一代食品安全快速检测技术的发展提供了新的思路。

参考文献

[1] Izumi S, Miura D, Maeda Y, Sode K, Tsugawa W, Ikebukuro K, Asano R. Convenient and sensitive detection of viable Escherichia coli employing a sequential reaction between antibody-enzyme complexes. Biosensors and Bioelectronics. 2026, 309:118810.