单叠氮丙啶qPCR法测定海产品中大肠杆菌含量的优化

  大肠杆菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，天然存在于人类和其他动物的胃肠道中。虽然这些共生大肠杆菌菌株中的大多数是无害的，但许多是致病性的，可引起人类疾病。大肠杆菌的致病菌株可能是更可公开识别的食源性病原体之一，尽管只有某些病原体，如肠出血性大肠杆菌(例如，大肠杆菌O157：H7)会引起疾病。大肠杆菌已从不同来源分离出来，包括双壳类软体动物及其周围水域。因此，食用生的或稍微煮熟的贝类可能对公众健康构成潜在风险，特别是因为它们的滤食活动会导致病原微生物的积累和浓缩。

  不同国家的监管限制和监测计划使用双壳类软体动物的大肠杆菌或粪便大肠菌群计数及其生长区域来评估安全性。通常用于定量食品中大肠杆菌和食源性病原体的方法是基于培养的。这些方法既费力又耗时，并且无法检测处于可行但不可培养(VBNC)状态的微生物。另一方面，定量PCR(qPCR)已被证明对检测不同食物基质中的细菌具有快速和灵敏性。然而，这种技术无法区分活细菌和死细菌，因为DNA在细胞死亡后可以保持完整，导致对细菌种群的高估。

  该研究比较了不同浓度的单叠氮丙啶(PMA)、光照时间和光照强度，以确定量化细胞悬浮液和食物基质中活大肠杆菌(E.coli)的最佳条件。评估了不同浓度的PMA(20μM、40μM、50μM、60μM和80μM)，以及5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟的暴露时间，以及500 W和650 W的光照强度。将PMA-qPCR方法应用于不同组成的活的和热杀的大肠杆菌悬浮液，浓度范围为3 Log至7 Log CFU/mL。用活的但不可培养的(VBNC)状态的大肠杆菌制备相同的稀释液，并将其应用于食品基质中。将qPCR、PMA-qPCR和平板计数的结果进行比较，以评估PMA在抑制死细胞扩增方面的有效性。将PMA-qPCR方法应用于接种热灭活大肠杆菌细胞的牡蛎样品，以评估其检测能力。该研究建议进一步研究，特别是使用不同的食品基质，以验证PMA-qPCR在细菌定量中的应用。

  确定量化细胞悬浮液和食物基质中存活的大肠杆菌(大肠杆菌)的最佳条件是在650 W的光强度下使用50 μM PMA，持续 15 分钟。这种方法有效抑制了死细胞的扩增，与培养依赖性方法相比，有望量化细菌。但是，仍可能出现假阳性，具体取决于样本中大肠杆菌的水平。建议进一步研究，尤其是使用不同的食物基质进行研究，以验证PMA-qPCR在定量细菌方面的应用。

  但是，该研究仅侧重于优化用于量化生海鲜中存活的大肠杆菌(大肠杆菌)的PMA-qPCR方法，不探索其他细菌物种或食物基质。根据对牡蛎样本中大肠杆菌的检测，评估了PMA-qPCR方法的有效性，建议进一步研究以验证其在不同食物基质中的应用。该研究没有调查pH值或其他微生物的存在等其他因素对PMA-qPCR方法性能的潜在影响。而且本文也没有讨论与定量细菌的培养依赖性方法相比，实施PMA-qPCR方法的成本效益或实用性，还需要做进一步研究。