揭秘单核细胞增生李斯特菌的毒力调控：LIPI-4的关键作用

近年来，研究人员发现李斯特菌致病岛4（LIPI-4）在单核细胞增生李斯特菌引起的中枢神经系统感染和母婴感染中发挥着关键作用。然而，LIPI-4在李斯特菌致病机制中的具体作用尚不清楚。最近，一项发表在《Virulence》杂志上的研究深入分析了LIPI-4的功能，揭示了其在调节李斯特菌毒力中的重要作用。

单核细胞增生李斯特菌的LIPI-4基因簇最初是在对人类李斯特菌病病例和食品来源的李斯特菌克隆进行多基因座序列分型（MLST）分析时发现的。研究发现，克隆复合体4（CC4）菌株与人类感染的关联度远高于其在食品中的流行率，因此被认为是高毒力克隆。通过对CC4菌株进行全基因组测序，研究人员发现了一个独特的基因组簇，包含六个基因，这些基因被注释为纤维二糖家族磷酸转移酶系统（PTS），在其他主要李斯特菌克隆中缺失。实验验证表明，这些基因在介导神经毒力和胎盘毒力中起着关键作用，因此被命名为LIPI-4。

研究方法

本研究使用了单核细胞增生李斯特菌野生型菌株LM928（CC87，ST87），该菌株于2015年从中国新疆的冷冻生鸡肉中分离。研究人员构建了LIPI-4缺失突变株（ΔLIPI-4）和互补株（CΔLIPI-4），并对其进行了系统评估。实验中使用了多种细胞系，包括人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）、人胎盘滋养层细胞系（HTR-8/Svneo）、人结肠腺癌细胞系（Caco-2）、小鼠成纤维细胞系（L929）和小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）。

突变株和互补株的构建

研究人员通过同源重组技术构建了LIPI-4缺失突变株。首先，设计了一个包含LIPI-4上游和下游同源臂的质粒。通过PCR扩增这些区域，并将其克隆到pMD19-T载体中，构建了重组质粒pMD19-T-ab。然后，将温度敏感型质粒pKSV7-ab（通过将ab片段亚克隆到pKSV7载体中构建）电穿孔到感受态细胞中，并在30°C下恢复24-36小时。通过在含有氯霉素的BHI琼脂平板上筛选单交换整合子，并在42°C下培养以选择重组子。通过PCR和Sanger测序验证了ΔLIPI-4突变。为了构建互补株CΔLIPI-4，研究人员使用了强组成型启动子Phelp，将重组质粒pIMK2-LIPI-4通过电穿孔引入感受态细胞中，并通过卡那霉素抗性筛选、PCR扩增和测序确认了成功转化。

生长曲线测定

研究人员将LM928、ΔLIPI-4和CΔLIPI-4菌株接种到BHI培养基中，并在37°C下培养。每隔2小时测量一次OD600值，以评估菌株的生长情况。结果显示，LIPI-4缺失并未显著影响李斯特菌的生长。

侵袭和细胞内增殖实验

研究人员评估了LM928、ΔLIPI-4和CΔLIPI-4菌株在Caco-2、hCMEC/D3、HTR-8/Svneo和RAW264.7细胞系中的黏附和侵袭能力。结果显示，ΔLIPI-4菌株在hCMEC/D3、HTR-8/Svneo和Caco-2细胞系中的黏附效率显著降低。此外，ΔLIPI-4菌株在所有测试细胞系中的侵袭效率也显著降低。在细胞内增殖实验中，ΔLIPI-4菌株在Caco-2、hCMEC/D3、HTR-8/Svneo和RAW264.7细胞中的增殖能力显著受损。

细胞间传播实验

研究人员通过在L929细胞中进行噬菌斑形成实验，评估了LM928、ΔLIPI-4和CΔLIPI-4菌株的细胞间传播能力。结果显示，野生型LM928菌株形成了广泛的噬菌斑，而ΔLIPI-4和CΔLIPI-4菌株的噬菌斑形成能力显著减弱。

鞭毛形成和运动能力实验

研究人员通过半固体平板和穿刺实验评估了LM928、ΔLIPI-4和CΔLIPI-4菌株的运动能力。结果显示，ΔLIPI-4菌株在28°C和37°C下的运动能力显著降低。透射电子显微镜（TEM）观察显示，ΔLIPI-4菌株在28°C下未能形成鞭毛，而野生型LM928菌株则形成了典型的鞭毛结构。实时定量PCR（RT-PCR）分析显示，ΔLIPI-4菌株中flaA、fliI、flgK和degU基因的转录水平显著降低。

转录组分析

研究人员对LM928和ΔLIPI-4菌株在28°C和37°C下的转录组进行了分析。结果显示，在28°C下，ΔLIPI-4菌株中有237个差异表达基因（DEGs），其中94个下调，143个上调。在37°C下，ΔLIPI-4菌株中有463个DEGs，其中268个下调，195个上调。KEGG通路分析显示，这些差异表达基因主要与微生物代谢、碳代谢、磷酸转移酶系统和果糖/甘露糖代谢等通路相关。

研究结果

LIPI-4缺失对李斯特菌生长的影响

研究人员发现，LIPI-4缺失并未显著影响李斯特菌在37°C下的生长曲线。这表明LIPI-4在李斯特菌的基本生长过程中并非必需。

LIPI-4缺失对李斯特菌侵袭能力的影响

ΔLIPI-4菌株在hCMEC/D3、HTR-8/Svneo和RAW264.7细胞系中的黏附效率显著降低。此外，ΔLIPI-4菌株在所有测试细胞系中的侵袭效率也显著降低。这些结果表明，LIPI-4在李斯特菌的细胞黏附和侵袭过程中起着重要作用。

LIPI-4缺失对李斯特菌细胞内增殖和细胞间传播能力的影响

ΔLIPI-4菌株在Caco-2、hCMEC/D3、HTR-8/Svneo和RAW264.7细胞中的增殖能力显著受损。此外，ΔLIPI-4菌株在L929细胞中的噬菌斑形成能力显著减弱。这些结果表明，LIPI-4对于李斯特菌在宿主细胞内的增殖和细胞间传播至关重要。

LIPI-4缺失对李斯特菌鞭毛形成和运动能力的影响

ΔLIPI-4菌株在28°C和37°C下的运动能力显著降低。TEM观察显示，ΔLIPI-4菌株未能形成鞭毛。RT-PCR分析显示，ΔLIPI-4菌株中flaA、fliI、flgK和degU基因的转录水平显著降低。这些结果表明，LIPI-4通过调节鞭毛形成来影响李斯特菌的运动能力。

参考文献：1、Liu C, Ma X, Jia B, et al. Function analysis of LIPI-4 in Listeria monocytogenes reveals a key role of flagella formation in the regulation of virulence. Virulence. 2025;16(1):2543144. doi:10.1080/21505594.2025.2543144