猪肉中霉菌毒素的检测您知多少

  在食品污染中，霉菌毒素因其极强的毒性和致病性而备受关注。赭曲霉毒素是毒性最大、分布最广的真菌毒素之一，可分为A、B、C等结构相似的真菌毒素。其中赭曲霉毒素A (OTA)因其肾毒性、致突变性、致残性和致癌性，被国际癌症研究机构(IARC)归类为2B类致癌物。它主要存在于医药产品和食用食品等各种基质中。由于其极好的热稳定性和化学稳定性，最终可以通过食物链在动物和人类体内富集，对动物和一般人群的健康都有很大影响。此外，欧盟委员会还规定了粮食(5 μg/kg)、可可(2 μg/kg)、果汁(2 μg/kg)、等食品中OTA的最大容许量(MTL)。中国的国家标准(GB 2761)还增加了葡萄酒(2 μg/kg)和咖啡(5 μg/kg)中OTA的最高限量。因此，有必要建立一种灵敏、有选择性的OTA检测方法。目前OTA的检测主要采用液相色谱-质谱、高效液相色谱[和薄层色谱等传统方法。但由于成本高、灵敏度低、样品预处理复杂，这些方法的应用仍受到限制。

  摘要：合理设计高性能纳米酶在生物传感器中具有重要意义。本研究以分子式咪唑酸骨架-8 (ZIF-8)为前驱体，通过对ZIF-8@zeolitic咪唑酸骨架-67 (ZIF-8@ZIF-67)的高温热解，制备了具有空心核壳结构的Co纳米粒子/N掺杂碳纳米管(Co/NCNT)，其中ZIF-8@ZIF-67不仅被功能化为N和C的来源，用于NCNTs的生长，还提供了形成空心结构的模板。纳米Co纳米颗粒在纳米碳纳米管中的包封可以有效地固定活性位点，避免自团聚。Co NPs与NCNT的协同作用有利于显著提高氧化酶模拟活性，而中空结构促进活性位点与底物的结合，提高反应速率。因此，Co/NCNT在没有H2O2的情况下具有催化无色3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)的氧化酶模拟活性，而蓝色TMB+也可以通过内滤效应猝灭AuAg纳米簇(NCs)的荧光。建立了一种比色-荧光双模免疫传感器，能灵敏地检测赭曲霉毒素A (OTA)，线性检测范围为0.001 ~ 10 μg/L，低检出限分别为0.21 ng/L(比色)和0.17 ng/L(荧光)。由于信号的独立性和相互印证性，双模免疫分析法对OTA的检测比单模免疫分析法更准确、可靠。重要的是，该策略为基于mof的纳米酶的设计和食品视觉分析的创新灵感奠定了坚实的基础。

  Co/NCNT作为氧化酶模拟物的双模免疫传感器示意图

  本研究以ZIF-8为前驱体，通过时效反应形成ZIF-8@ZIF-67。在此基础上，通过对ZIF-8@ZIF-67的高温热解，得到了具有中空核壳结构的Co/NCNT。其中，ZIF-8@ZIF-67不仅为金属Co纳米颗粒催化的N掺杂碳纳米管的生长提供了C和N的来源，而且还充当了形成空心碳骨架的模板。此外，中空结构的形成不仅促进了催化剂与底物的结合，提高了反应速率，还为Co/NCNT提供了较大的比表面积，提高了活性位点的暴露度和催化性能。基于以上优点，Co/NCNT在免疫分析中表现出良好的氧化酶模拟活性。如方案1所示，经过特异性免疫竞争反应后，在没有H2O2的情况下，具有氧化酶活性的Co/NCNT催化无色TMB生成蓝色TMB+。同时，通过简单的水热法合成了AuAg NCs，并将其作为荧光探针，由于内部过滤作用，可以被蓝色TMB+快速猝灭。通过比色和荧光双信号的相互验证，制备了用于OTA免疫分析的双模免疫传感器。

  ZIF-8 @ZIF-67的TEM和EDS元素映射

  以ZIF-8为模板，通过时效反应合成了ZIF-8@ZIF-67。扫描电子显微镜(SEM)图像显示，ZIF-8和ZIF-8@ZIF-67具有明显的菱形十二面体结构，表面光滑，尺寸分布均匀。其中，ZIF-8的尺寸约为700 nm，而ZIF-8@ZIF-67的尺寸明显较大。另外，在上图中，ZIF-8@ZIF-67为典型的十二面体，边长约为900 nm，与扫描电镜结果一致。图中的映射图像清楚地显示N、C、Zn、Co元素分布均匀。特别是Co元素均匀分布在Zn元素的外围，进一步证明了ZIF-8@ZIF-67的核壳结构。在Ar/H2中通过高温炭化ZIF-8@ZIF-67制备了具有空心核壳结构的Co/ NCNT(图2A)。经过高温热解，ZIF-8@ZIF-67的十二面体形状得到了很好的保存，但其表面变得更加粗糙(图2B)。在粗糙的表面可以观察到许多碳纳米管(如图2B所示)。同时，ZIF-8@ZIF-67中的Zn颗粒被汽化，导致ZIF-8结构消失，形成中空结构[34]。这一现象与以往报道的MOFs在不活跃气氛下直接热解形成微孔碳和/或单金属纳米颗粒复合材料的研究有明显不同。

Co/NCNT的合成工艺以及低(B)和高(C和D) TEM图像和相应的选择

  通过稳态动力学分析估算了Co/NCNT的动力学参数，研究了Co/NCNT的模拟氧化酶活性。具体工艺为:在400 μL, 0.2 M, pH=4的HAc- NaAc缓冲液中加入40 μL Co/NCNT，去电离水保持600 μL的总体积不变。在TMB浓度从0.1 mM到0.9 mM范围内，记录了652 nm处的吸收峰强度随时间的变化。

  Co/NCNT的XPS谱。(A)全谱，(B) C 1s (C) N 1s和(D) Co 2p的反褶积

  通过XPS分析进一步揭示了Co/ NCNT的表面结构和各元素的化学状态。Co/NCNT的XPS全谱图表明，复合材料主要由Co、O、N和C元素组成。其中C和N主要来源于N掺杂的CNTs骨架，Co主要来源于Co NPs的主成分，O来自吸附在样品表面的空气中的氧。为了探究元素的化学环境，进一步对Co/NCNT中的Co 2p、N 1s和C 1s进行反褶积。284.3 eV、284.7 eV、285.6 eV和286.1 eV处的C 1s特征峰分别对应于C-C、C—C、C—N和C-N[30,34]，其中C-C/C—C主要来自碳纳米管中的苯环。上图为N 1s的反褶积图，其中氧化N (403.1 eV)、石墨N (401.3 eV)、吡咯N (400.6 eV)、Co-N (399.8 eV)和吡啶N (398.6 eV)[32]可划分为5个不同的特征峰。其中，吡咯N (400.6 eV)和吡啶N (398.6 eV)的存在进一步证实了C-N键的形成，Co-N键(399.8 eV)的存在证明了Co- NPs成功引入到N掺杂的CNTs中。Co 2p的反褶积得到Co0、Co3+和Co2+三种价态。Co NPs (Co0)在794.7 eV和779.2 eV处有两个明显的峰值，可归因于Co 2p1/2和Co 2p3/2。795.4 eV和780.2 eV处的峰属于Co3+， 798.4 eV和782.9 eV处的峰属于Co2+，与Co3O4完全对应。803.9 eV和787.3 eV处的峰是Co 2p的卫星峰。因此，Co/NCNT中存在Co NPs (Co0)和Co3O4 (Co2+和Co3+)。这与XRD分析基本一致。

  通过(A)改变TMB的浓度和(B)相应的双倒数图对Co/NCNT进行稳态动力学分析

  图A和B显示了以TMB为底物的Co/ NCNT氧化酶模拟物的Michaelis-Menten动力学曲线。通过Lineweaver-Burk计算，Co/NCNT氧化酶模拟物的Km值为0.39 mM，显著低于HRP (Km =0.43 mM)和其他纳米酶，说明Co/NCNT氧化酶模拟物对TMB具有更高的亲和力和更好的催化活性。N元素的掺杂可以通过疏水相互作用和π-π带[42]提高Co/NCNT对TMB的亲和力。此外，通过zeta电位测量进一步检测了催化剂的表面电荷。如图S3所示，Co/NCNT表面在水和NaAc-HAc缓冲溶液(pH 4.0)中均带负电。而TMB在酸性介质[30]中带正电，因此Co/NCNT与TMB之间的静电相互作用可以提高Co/NCNT对TMB的亲和力。

  高分辨率TEM图像，粒径分布，元素映射荧光发射光谱

  如上图TEM图像所示，AuAg NCs呈准球形结构，尺寸分布均匀。HRTEM图像显示，单个AuAg NCs的晶格间距分别为0.235 nm和0.212 nm，分别属于金和银的晶面。在上图中，AuAg NCs的平均粒径主要在1.5 ~ 3.0 nm之间。此外，在映射光谱中，金、银元素分布均匀，进一步证明银元素的引入是成功的。随后对荧光强度进行分析，进一步证明银元素的掺入。在可见光下，AuAg NCs的颜色与纯Au NCs的颜色几乎相同，而在365 nm处，AuAg NCs明显比纯Au NCs表现出更耀眼的黄色荧光。这种现象可以在荧光光谱中更直接地看到。AuAg NCs的荧光强度是纯Au NCs的4倍，证明银元素的加入大大提高了荧光强度，有利于荧光检测。此外，还研究了蓝色TMB+在580 nm处猝灭AuAg NCs的荧光可归因于内部过滤效应。换句话说，TMB+对AuAg NCs发射光的吸收导致AuAg NCs的荧光强度降低。如图所示，不同浓度的Co/NCNT加上一定浓度的TMB可生成不同浓度的TMB+。取反应液，与固定浓度的AuAg NCs孵育10 min (b, c)后，其580 nm处的荧光强度较未加Co/NCNT时显著降低(a)。当高浓度Co/NCNT与TMB反应产生的TMB+浓度达到一定水平时，可完全猝灭AuAg NCs的荧光。

  不同浓度的紫外-可见光谱和荧光光谱图

  通过紫外-可见分光光度法在652 nm记录Abs的强度，考察了Ag、Ab1、Co/ NCNT-Ab2的浓度和免疫时间等影响因素。如图所示，随着Ag浓度的增加，在5 μg/mL之前，浓度有急剧上升的趋势，之后有小幅上升。因此，以5 μg/mL为最佳浓度。然后考察了Ab1浓度的影响。从图中可以看出，随着Ab1浓度的增加，强度有明显的增加，而在浓度为5 μg/mL时强度更高。随后研究了Ag与Ab1的反应时间。如图S8C所示，反应时间从20到60 min，强度随时间增加而增加，但当反应时间超过60 min时，强度变化不大，即反应完成。因此，Ab1的最佳浓度和反应时间为5 μg/mL和60 min。优化了Co/NCNT-Ab2的浓度。由图S8D可知，当Co/NCNT-Ab2的浓度为0.5 mg/mL时，强度达到最大值，在浓度为0.5 mg/mL至1.0 mg/mL时，强度基本保持不变。因此，Co/NCNT-Ab2的最佳浓度为0.5 mg/mL。

  比色-荧光免疫传感器的稳定性和重现性

  在实际样品中，重复性和稳定性是很重要的。选择5种不同浓度的OTA(10、1、0.1、0.01和0.001 μg/L)，用相同的免疫传感器评价其稳定性。从图A-B可以看出，在储存7天后，比色检测和荧光检测的性能没有明显变化，说明该免疫传感器对OTA的检测具有良好的长期稳定性。随后，在相同的OTA浓度(0.1 μg/L)下，选择5个不同批次的独立免疫传感器，考察其重复性。不同批次传感器的比色和荧光检测差异不大(图7C-D)，重现性好，可以满足未来应用中实际样品的检测。选择黄曲霉毒素B1 (AFB1)、微囊藻毒素yr (MC-YR)微囊藻毒素lr (MC-LR)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和脱氧雪腐菌醇(DON)等类似毒素，以探索比色-荧光免疫传感器检测OTA的特异性。5种干扰毒素无论是比色法检测还是荧光法检测，对OTA检测均无明显影响，证明免疫传感器具有良好的特异性，为复杂的实际检测提供了理论依据。通过对商品玉米和小米样品中OTA含量的检测，验证了该免疫传感器的可行性。

  比色-荧光免疫传感器的特异性和玉米和小米基质中的回收率

  将玉米和小米样品分别溶解在混合溶液(VC9H8O4:VH2O:VCH3COOH = 79:20:1)中。超声混合后，用0.22 μ m过滤膜进行多次过滤。然后按照标准添加法，分别在玉米和小米样品中注入0.04、0.08和0.12 μg/L的OTA加标溶液。由上图可知，比色-荧光双模免疫传感器对玉米和小米的回收率分别为95.0% ~ 107.5%(比色检测)和95.0% ~ 103.8%(荧光检测)。

  总结：综上所述，通过对前驱体ZIF-8@ZIF-67进行高温炭化，成功合成了具有空心核壳结构的Co/NCNT。其中，ZIF-8@ZIF-67不仅为在-中形成的Co纳米颗粒催化的NCNTs提供了C和N的来源原位还充当了形成空心框架的模板。利用Co/NCNT中空核壳结构的优点，设计并构建了高效、灵敏检测OTA的比色荧光免疫传感器。中空结构的形成促进了催化剂与底物的结合，有利于提高反应速率。此外，Co NPs与NCNT的协同作用有利于暴露更多活性位点，提高Co/ NCNT的氧化酶活性。因此，比色信号和荧光信号均与OTA浓度信号呈良好的线性关系，且两者信号相互印证，进一步提高了双模免疫传感器的检测精度。重要的是，比色-荧光双模免疫传感器的构建不仅实现了实际样品中OTA的检测，而且通过改变相应的抗原和抗体，为食品中其他污染物的检测提供了策略。

  参考文献：

  Mengting Chen, Zexuan Liu, Yinyin Guan, Yuxuan Chen, Weipeng Liu, Yingju Liu. Zeolitic imidazolate frameworks-derived hollow Co/N-doped CNTs as oxidase-mimic for colorimetric-fluorescence immunoassay of ochratoxin A. Sensors&Actuators：B.Chemical359(2022)131609.

  DOI：10.1016/j.snb.2022.131609