VAMPr：通过可解释的特征和机器学习进行变异映射和抗生素耐药性的预测

AMR严重危害全球公众健康。抗生素疗效降低可导致住院时间延长和死亡率增加。目前，常规用来确定一种分离株对一种特定抗生素敏感或者耐药的方法仍然是依赖于培养的表型技术。此技术耗时长，尤其是应对生长较为缓慢的病原，检测周期的延长极可能导致有效治疗的延迟。靶向式的基因型AST技术，如PCR，能够有效地缩短检测周期。但是这种技术只能识别众多耐药基因的一个子集，无法提供对抗性表型的完整解释。从基因组数据出发去预测AMR，能够避免靶向式的缺陷，已成为一大研究热点。现今，已有不少科研小组建立了相关AMR预测模型，以基于基因组信息准确可靠地完成表型预测。这些模型大多是基于K-nn或adaBoost算法去识别病原体基因组中的抗性基因或者短核苷酸序列，尚未利用到基因的同源特征。另外，尽管资源的投入，当前许多病原体-抗生素组合的耐药机制仍然没有被很好地描述，这阻碍了我们对基因型-表型关系的全面理解。基于此研究背景，Jiwoong Kim等人开发了一种新的生物信息学工具，VAMPr，用于细菌耐药性的研究。VAMPr的工作流程见图1，通过从NCBI下载相应的基因组数据及其对应的表型数据，利用这些菌株信息进行基因型-表型的关联和预测分析。在关联分析中，作者基于KO基因构建了数据驱动的关联模型，以实现在大量的细菌分离株中对基因型和表型将进行无偏倚的筛选。具体操作如下：利用KEGG建立了一个包含基因变异的KO基因参考数据库，这些KO基因对应着AMR蛋白序列和AMR样蛋白序列。这种样序列对应于尚未与耐药性建关联但可以提高变异呼叫准确性的KO基因。AMR样蛋白与AMR蛋白序列具有80%的相似性。蛋白序列通过KEGG API和UniProt ID定位AMR KO基因获得，且非AMR KO基因对应的蛋白序列也会与AMR蛋白序列进行比对，以避免AMR样蛋白遗漏。在预测分析中，作者基于机器学习构建了一个预测模型，根据NGS数据对每种病原菌-药物组合耐药性进行预测。概括地说，作者从NCBI SRA中获得了4515个细菌全基因组序列（Illumina平台）和NCBI BioSample Antibiograms for phenotype中检索出对应的AMR表型。对获得的短读序列进行从头组装（de novo）并与MLST数据库进行比对以确定细菌的种类。此操作过滤掉了1100个菌株，这些菌株存在物种鉴定不准确的问题。最终确定的分析队列（3393株）为：肠道沙门氏菌（1349）、鲍曼不动杆菌（772）、大肠杆菌（350）、肺炎克雷伯菌（344）、肺炎链球菌（317）、铜绿假单胞菌（83）、阴沟肠杆菌（79）、产气克雷伯氏菌（68）和金黄色葡萄球菌（31）。在这里，也统计了这些菌株对29种不同抗生素的MIC值（共38,871个），去除MIC被错误注释的或者表型表现为“Intermediate（I）”的菌株后，剩38,248个有效的病原菌-抗生素数据点（图2A）。总的来说，此次筛选获得了一个数据集，涉及93种物种-抗生素组合，用于后续关联和预测模型的构建。

在研究内容上，作者首先搭建了蛋白数据库：首先根据筛选后的基因组数据进行KEGG分析后整理537个同源（KO）基因并识别-定位-下载到298,760条蛋白序列。然后，对这些蛋白质序列进行聚类分析（最小序列相似性设定为0.7），得到的96,462个KO基因簇即作为AMR蛋白序列数据库。随后，作者分析选定的3393个从头组装的基因组，明确基因位置，并将基因序列与参考AMR蛋白序列库进行比对，由此可以筛选出每个分离株的耐药基因。另外，也通过多序列比对软件进行检测相应变异位点（如氨基酸替换）。然后，对此数据库进行评价，结果显示，对于某些细菌-抗生素组合，关联模型的准确性大于95%，但是某些组合的准确性就明显偏低，例如铜绿假单胞菌-氨曲南：69.6%，但总体平均准确性为91.1%（图2B）。利用基因/变异信息和抗性表型的列联表，以及适当的统计分析（来自Fisher精确检验的优势比和p值），作者发现了5359个具有强关联的子集（错误发现率＜0.05），这些强关联往往与某些明确的耐药机制相对应。例如，序列变异K18768.0代表β-内酰胺酶（Bla）编码基因blaKPC，blaKPC的存在与肺炎克雷伯菌的美罗培南耐药性显著相关（p<0.0001）（图3A）。序列变异K18093.13代表oprD，oprD是假单胞菌摄取碳青霉烯类抗生素的主要孔蛋白，oprD的失活会导致碳青霉烯类耐药性，而野生型oprD的缺失与亚胺培南耐药性密切相关（p<0.0001）（图3B）。其它强关联例子还包括OXA-1和aac-(6’)-lb)，详见图3C和D。这些结论证明了关联模型能够准确地检出已知的耐药因子。不过，是否此方法能够根据基因序列信息稳健地预测耐药表型，还需要进一步探究。对此，作者基于数据中的93种物种-抗生素组合开发了93种不同的预测模型。在这里，作者尝试了多种算法构建模型，包括弹性网络回归、支持向量机、三层神经网络、自适应增强以及极端梯度增强树，发现这些算法中给出极端梯度增强树算法表现性能最好。在基于极端梯度增强树算法构建的93个预测模型中，有一半的预测准确率大于90%，且肺炎链球菌-克林霉素、肺炎链球菌-美罗培南、肺炎链球菌-四环素、大肠杆菌-卡那霉素这几个组合的预测准确率高达100%；另外，11个针对沙门氏菌的预测模型也具有非常高的精度（≥98.0%）（表1）。

文章的最后，作者采用外部菌株（不在NCBI数据库上）进一步验证VAMPr的预测性能，这些菌株包括13株阴沟肠杆菌、31株大肠杆菌、24株肺炎克雷伯菌和21株铜绿假单胞菌。值得注意的是，这些菌株中分别含有62%、15%、28%和31%的变异位点（不存在先前使用的菌株中）。根据基因组数据进行预测，并与相应表型结果进行比较，得到结果如图4所示（仅展示了三个AUROC值最高的预测结果及其在梯度增强树模型中经常出现的重要遗传变异）。另外，在研究的所有物种-抗生素组合中，预测模型的最小AUROC值为0.70（表2）。此外，作者还检索了1688株肺炎克雷伯菌菌菌株来验证VAMPr模型，也观察到相似的AUROC值。这些结果表明，所建立的VAMPr预测模型既能够识别已知的耐药基因和变异位点，也能够识别列表之外的耐药基因或变异位点。

总的来说，作者开发的VAMPr生信分析管道能够直接从NGS Reads中找出变异水平的遗传特征，并与耐药表型进行关联，预测准确率高于已开发的其它预测方法。此预测模型不仅能明确基因存在/缺失或者发生/没发生突变，还能告知这些序列变异给表型（氨基酸）带来的影响。研究基于大数据和机器学习开发的预测模型，能够无偏倚地识别特定的耐药基因/位点。实验时，通过将细菌基因组与一组一致的同源基因序列进行比对，即可以确定分离株中任何特定AMR基因存在的变异。此特点不仅可以帮助科研工作者确认已知的抗性标记，还有助于发现新型抗性标记。不过，值得关注的是，模型中确定为预测表型的标记与表型并不一定具有“因果”关系。文中展示的是相关性，至于这些抗性标记是否“活跃”，还需“湿实验”进行进一步验证。另外，在利用NCBI外部菌株进行验证模型预测性能时，也观察到性能受到了影响。对此，作者给出的解决方案是，增加相应的菌株数据库，以丰盈预测模型。简而言之，作者开发的VAMPr有助于加强基因组数据和耐药性之间的关联，在未来具有较强的应用价值。

图1 VAMPr的工作流程。VAMPr管道处理了来自NCBI Short Read Achieve（SRA）和NCBI BioSample Antibiograms for phenotypes的序列数据。筛选的AMR基因型和AMR表型被用于创建关联和预测模型。

图2 对93种物种-抗生素组合的显著变异关联和预测准确性的总结。两张热图都显示了9种细菌与29种抗生素（13类）的分离株的计数。图中，没有数字的盒子代表检测面板内不含有此种病原-抗生素组合。（A）方框的颜色表示与VAMPr关联模型中FDR调整后的p值<0.05相关的基因-抗生素耐药性关联的数量，实际数字显示在括号内；（B）颜色表示VAMPr预测模型的交叉验证预测精度，具体数值显示在括号内。

图3 由关联模型决定的变异-表型关系的例子。（A）K18768.0表示blaKPC，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶。blaKPC的存在与肺炎克雷伯菌对美罗培南的抗性有关。图中的数字代表示具有给定MIC值的分离株的数目。（B）K18093.13表示oprD，oprD的缺失与铜绿假单胞菌对亚胺培南的抗性有关。（C）K18790.0表示blaOXA-1，它的存在与大肠杆菌对头孢吡肟的抗性有关。（D）K19278.0是aac6-lb基因。该变异的存在与鲍曼不动杆菌对阿米卡星的抗性有关。x轴上的“+”和“-”分别表示基因存在和不存在。红色的水平线表示成组MIC测量值的平均值和标准误差。每个灰点代表一个MIC值。P值是根据Fisher的精确检验计算出来的。

图4 使用外部数据集验证预测模型。（A-D）大肠杆菌和美罗培南的AUROC曲线及预测相关耐药性着重考虑的三大指标；（B-E）肺炎克雷伯菌和头孢他啶的AUROC曲线及预测相关耐药性着重考虑的三大指标；（C-F）铜绿假单胞菌和美罗培南的AUROC曲线及预测相关耐药性着重考虑的三大指标。

表1 32个VAMPr预测模型的预测指标。在93个预测模型中，我们列出了平均预测精度高于95%的前32个模型。采用嵌套交叉验证的方法报告了准确性。10倍外交叉验证用于报告准确性，5倍内交叉验证用于超参数调优。

表2 VAMPr预测模型的外部验证。外部数据集包括13例阴沟肠杆菌、31例大肠杆菌、24例肺炎克雷伯菌和21例铜绿假单胞菌。所有分离株均对3种抗生素（头孢吡肟、头孢他啶和美罗培南）进行了检测。我们将精度报告为正确预测的分数，而AUROC（接收者操作者曲线下的面积）表示操作者-接收者特征下的面积。阴沟肠杆菌的AUROC值为n/a，因为所有13株菌株均对美罗培南敏感。

原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007511