两个同义单核苷酸多态性促进环境中大肠杆菌氟喹诺酮耐药性

耐药大肠杆菌（E. coli）是环境污染的一个主要问题。单核苷酸多态性（SNP）是E. coli耐药性的核心机制之一，其中，非同义SNPs得到了广泛关注，而同义SNPs常常被故意忽视掉。同义SNPs，被定义为一种“沉默的”SNPs，因其不改变编码的氨基酸。不过，同义SNPs对mRNA剪接、核-胞质输出、稳定性和翻译的影响不容忽视。因而，了解同义SNPs的抗性机制对于改进临床抗菌治疗策略至关重要。为此，暨南大学孙雪松团队利用其自开发的抗性SNPs预测算法：基于多位点序列分型的表型-单核苷酸多态性分析（MIPHA），及湿实验验证，确定了位于HisD基因上的2个关键同义SNPs：522 G>A和972 C>T与E. coli耐药性的相关性，并首次阐明了HisD基因在环境E. coli样本中的耐药机制。总的来说，此研究为了解同义SNPs在介导细菌抗生素耐药性中的作用提供了有价值的见解，并为治疗耐药细菌引起的环境污染提供了新的视角。

抗生素被誉为“20世纪最伟大的医学突破之一”，因为它拯救了无数的急性细菌感染的患者。然而，在农业实践中，特别是畜牧业中，抗生素的滥用和不当使用，导致了环境中耐药细菌的迅速出现。E. coli广泛存在于农场和饮用水等环境中，抗生素的过度使用将促使环境中E. coli的耐药性，这不仅可能对猪和牛等牲畜构成风险，还可能通过食物链导致人类感染。因而，研究环境中E. coli的耐药性是一个研究热点及重点。目前，SNPs，特别是非同义SNPs，已被认为是抗生素耐药性的关键因素，吸引了众多研究人员的目光。然而，事实上，同义SNPs也在细菌适应各种环境中发挥着重要作用，特别是在应对环境应激中。尽管目前有小部分研究已经确定了可能与抗生素耐药性相关的同义SNPs，但鲜有研究进行湿实验验证，特别是与环境相关的案例。为此，孙雪松团队借助其自开发的生物信息学手段来筛选环境E. coli样本中与抗生素耐药性相关的同义SNPs，并通过湿实验明确了2个与氟喹诺酮耐药性相关的同义SNPs，且揭示了它们介导的抗性机制。

作者从NCBI收集了4598株大肠杆菌的WGS数据和表型数据，其中包括3533份环境来源的样本。从这些数据集中，作者首先筛选出了116个具有高精度、灵敏度和特异性的SNP（“得分最高”的SNP）。不过，这些SNPs并不一定都会产生抗生素耐药性，例如ansB（882 C>T）（图1 A）。这种情况可能是由于潜在的数据失衡，例如，在携带ansB（882 C>T）的样本中，ST 131所占比例过高（图1B），干扰了正常的数据分析。为进一步明确ST 131过度代表的影响，作者比较了在包含和不包含ST 131样本数据集中116个SNPs和已知环丙沙星耐药SNPs的定量值的变化（图1C）。虽然在两个数据集之间，已知抗性SNPs的定量值分布没有差异，但在没有ST131样本的数据集中，“得分最高”的SNPs的定量值显著下降，特别是精度下降。此外，在其他序列类型中也可以观察到这种差异（图1D）。由此，作者引入了MLST，以根据亲缘背景对同义SNPs进行打分，避免“种群效应”。基于此，作者开发了一个生物信息管道：MIPHA（图1E），并利用MIPHA计算每个ST的SNPs的总性能分数，表征了已知耐药SNPs和“得分最高”的SNPs的评分精度、特异性分布（图2A）和精度、灵敏度分布（图2B）。结果显示，大多数已知的耐药SNPs的精确性和特异性评分为正，而大多数“得分最高”的SNPs的精确性和特异性评分为负。由此显示出，MIPHA具备去除降低方法性能的SNPs的能力。紧接着，作者展开评估了MIPHA识别耐药SNPs的能力。在这里，作者基于已知耐药SNPs绘制了MIPHA和定量值两种方法的受试者工作特性曲线（ROC），并给出了两种方法的精确度和特异性的平均值（图2C，D）。这些结果表明，通过MIPHA计算出的已知抗性SNPs的得分不仅高于通过定量值计算出的得分，而且还出现在数据集中排名最高的区域；MIPHA的鉴别能力超过了量化值。另外，在环丙沙星数据集中，MIPHA发现SNP acrR(p. V29Yfs*44, g. 81delG)可以预测耐药性（图2E）。通过湿实验验证，结果显示此SNP确实能显著提高E. coli对环丙沙星的耐药性（图2F）。由此证明了MIPHA确实具备发现新的抗生素耐药相关SNPs的能力。

图1 采集数据集中的数据不平衡现象和MIPHA的工作流程。

图2 评价MIPHA算法在识别已知的抗性SNPs和新的抗性SNPs方面的作用。(A)已知的耐药SNPs（蓝色）和“得分最高”的SNPs（橙色）的精确度和特异性评分分布。(B)基于环丙沙星数据集计算出的SNPs的精度/精度评分和灵敏度值的组合分布。每个点代表一个SNP的精度/精度评分和灵敏度值。它们按已知的抗性SNPs（橙色），出现在左图第二个峰中的SNPs（绿色）和其余的SNPs（蓝色）进行分组。(C)鉴定已知抗性SNPs的ROC曲线和相关AUC值。(D)用MIPHA（蓝色）和定量值（橙色）计算的已知抗性SNPs的归一化秩。(E)利用环丙沙星数据集计算位于marR、soxR和acrR的SNPs的精度评分和敏感性值。每个点代表一个SNP的精度评分和灵敏度值。它们根据已知的抗性SNPs（橙色）、acrR（81delG）（红色）和其余的SNPs（蓝色）进行分组。(F)E. coliΔacrR：：acrR和E. coliΔacrR：：acrR（81delG）的环丙沙星MIC（μg/mL）。

随后，作者着重于MIPHA预测氟喹诺酮类耐药的同义SNPs工作。首先，作者运用富集算法富集了含有多个SNP的基因，且这些基因均被MIPHA确定为与抗性相关。在富集后的基因组数据集中，作者发现了3个同义SNPs，它们位于组氨酸脱氢酶基因HisD上，对Lev的抗性富集得分显著，如图3A所示。为证明HisD在细菌体内确实会产生Lev耐药，作者利用HisD过表达菌株（phisD菌株）和空载体控制菌株（pBADe菌株）在LB琼脂平板上进行菌落实验。结果显示，在Lev处理下，phisD菌株的菌落数明显明显高于pBADe菌株。此外，phisD菌株还表现出较强的对其他氟喹诺酮类抗生素即CIP、Nor和Mox的防御能力（图3B)。随后，作者选定Lev为下一步研究的主要代表药物，并测量了phisD和pBADe菌株对其他抗生素类别的交叉耐药性，包括Gen、Caz和Mem。结果显示，phisD菌株对Lev的MIC比pBADe菌株高64倍；这两种菌株在受到来自头孢菌素、氨基糖苷和碳青霉烯类药物的抗生素的攻击时，没有观察到差异（图3C）。在建立HisD与氟喹诺酮耐药的关联后，作者通过测定phisD菌株和突变的HisD过表达菌株[phisD（522 G>A）、phisD（972 C>T）、phisD（1050T>C）对Lev的MIC值，以进一步明确这3个同义SNPs对Lev抗性的影响。结果显示，phisD（522 G>A）和phisD（972 C>T）的Lev MIC显著降低，而phisD（1050 T>C）的MIC与野生型phisD菌株相当（图3D）。

在研究同义SNPs对HisD的影响之前，作者首先试图阐明HisD对氟喹诺酮类药物产生耐药性的分子机制，这在先前研究中尚未得到报道。鉴于HisD的主要作用是组氨酸的生物合成，作者首先假设phisD菌株通过增加组氨酸水平来增强菌株对氟喹诺酮类药物的耐药性。结果显示，在含有不同浓度组氨酸的M9培养基中，大肠杆菌BW25113对Lev的MIC值变化与组氨酸浓度的波动并不对应（图5A），由此显示出HisD的耐药机制可能与组氨酸的合成并无关系。然后，作者转向研究phisD和pBADe菌株的生长动力学（2 μg/mL Lev，24 h）。结果显示，在Lev压力下，这2种菌株的生长轨迹在前8小时内以几乎相同的速度上升，并且都在8-10小时内呈下降趋势。对于phisD菌株，在12小时抗生素处理后其生长开始恢复。这种生长恢复模式表明，Lev暴露处理10小时后，一些生物途径可能导致phisD被激活。用sanger测序检测不同浓度Lev处理后的pBADe和phisD菌株的氟喹诺酮耐药基因gyrA、parC和parE的QRDRs突变。结果显示，在用2 μg/mL Lev处理后的phisD菌株的gyrAQRDRs中检测到一种氟喹诺酮耐药突变(p. D87V, g. 260 T>A)（图4B）。gyrA（260 T>A）突变的具体时间为：第260位点的读数“A”在第10小时首次出现，在第12小时均变为“A”（图5B），这与phisD菌株的生长趋势一致（图4A）。在发现gyrA（260 T>A）出现的时刻后，作者着力于分析2 μg/mL Lev的phisD和pBADe菌株的蛋白质组谱，以进一步揭示HisD引起gyrA突变的机制。结果显示，Lev治疗后，pBADe组和phisD组分别有476个和462个差异蛋白（图4c）；在phisD组中，与自突变相关的蛋白SbmC表达上调，而在pBADe组中没有变化（图5C）。事实上，SbmC的下游蛋白UmuD，是一种sos诱导的自突变蛋白，已被报道为gyrA氟喹诺酮类QRDRs突变的原因。这一观察结果显示了phisD菌株通过过表达SbmC来保护自己的假说，从而进一步触发了UmuD的过表达，导致phisD菌株在gyrA上260位的“T”核苷酸突变为“A”。最终，这种突变使一些菌株在氟喹诺酮类药物的存在下存活，并成为群落中的优势菌株（图4D）。对此结果，作者也开展了qRT-PCR以进一步表征Lev处理后phisD菌株和pBADe菌株的umuD和sbmC的基因表达水平。结果显示，Lev处理后，phisD菌株的sbmC和umuD mRNA水平均显著升高，且显著高于pBADe菌株（图4E）。随后，作者敲掉E.coli中的Sbmc并过表达HisD，以证明Sbmc的关键作用。结果显示，与对照菌株（ΔsbmC_pBADe）相比，ΔsbmC_phisD菌株在药物压力下没有表现出任何生长优势（图4F）；而且，在没有sbmC的情况下，umuD的基因表达水平将保持不变（图5D）。ΔsbmC_pBADe和ΔsbmC_phisD菌株的umuD mRNA水平相似，而ΔsbmC_phisD中的HisD转录水平显著高于ΔsbmC_pBADe中。综合结果表明，phisD菌株的耐药性依赖于sbmC及其下游基因umuD的表达（图4D）。

在了解了HisD使细菌产生喹诺酮类药物耐药的分子机制后，作者继续定量分析了sbmC和umuD的基因表达水平，以确定先前确定的同义snp对HisD调控功能的潜在影响（图6A，B）。分析显示，phisD（522 G>A）和phisD（972 C>T）过表达菌株的sbmC和umuD的mRNA表达水平均低于phisD菌株。由此显示，这两个HisD同义变体phisD（522 G>A）和phisD（972 C>T）显著改变了HisD对gyrA的sbmC、umuD和QRDRs的调控功能。具体是如何改变的，作者主要分析了2个方面。一个是转录水平，一个是蛋白结构变化。结果显示，发生同义突变的2个菌株的mRNA水平显著低于phisD和phisD（1050 T>C）（图6C），这种mRNA水平差异与表型变化并不匹配。另一方面，作者对纯化的HisD、HisD（Q174Q）、HisD（G324G）和HisD（L350L）蛋白进行了蛋白酶消化分析。灰度分析显示，用蛋白酶消化10 min后，在37KDa处，HisD（Q174Q）和HisD（G324G）蛋白质片段数量是HisD和HisD（L350L）的2倍；消化20 min后，此结果也一致（图6D）。此现象可以解释为，HisD（522 G>A）和HisD（972 C>T）突变使得密码子发生了改变（CAG>CAA，GGC>GGU），可能会降低翻译速度，从而改变共翻译折叠途径。这种变化可以产生不同的蛋白质构象，从而影响蛋白质对蛋白酶降解的抵抗力。因此，作者作出推断，HisD（Q174Q）和HisD（G324G）的最终构象在共翻译折叠过程中发生了变化。为了模拟体内的减速和正常的共翻译折叠场景，作者分别比较了pBADe和phisD菌株在25◦C和37◦C下的Lev MIC（图6E）。结果显示，在较低温度下，各菌株间无显著性差异，而在37◦C时，phisD菌株的MIC显著高于pBADe菌株。与同义SNPs诱导的MIC降低一样，低温培养条件模拟的翻译速度降低也会导致HisD的功能损伤。这一发现支持了这些同义SNPs通过减慢转译过程导致HisD构象变化，最终导致其在细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性中失去调节作用的假设。

总的来说，作者应用其自开发的MIPHA算法从WGS-AST数据集中筛选出了一个尚未被研究的潜在氟喹诺酮耐药基因HisD的2个关键同义SNPs，并通过结合生物化学、分子生物学和定量蛋白质组学技术，证明了HisD和这2个同义SNPs与氟喹诺酮耐药的相关性，并阐明了相应的耐药机制：①phisD菌株首先过表达sbmC，然后进一步提高其下游基因umuD的表达，继而导致菌株gyrA的QRDRs区发生突变。这些结果导致氟喹诺酮类药物无法结合过表达菌株的突变GyrA，从而使它们无法杀死细菌。②HisD上的两个同义SNPs通过减缓HisD翻译速度以导致HisD正常功能的丧失。此MIPHA具有广泛的应用能力，可作为研究人员调查细菌抗生素耐药性和研究其背后机制的一个强大而可靠的工具。

图3 HisD上的2个功能沉默的同义SNP促进氟喹诺酮耐药。(A)左氧氟沙星数据集中的富集基因及其得分。根据基因的富集基因得分，将基因按降序排序。(B)pBADe和phisD菌株暴露于不同类型的氟喹诺酮类药物后的菌落形成单位（CFU）。(C)pBADe和phisD菌株针对不同抗生素的MIC值（μg/mL）。(D)phisD，phisD（522 G>A）、phisD（972 C>T）和phisD（1050 T>C）菌株的Lev MIC值。

图4 HisD依赖于sbmC和umuD促进抗生素耐药性

图5 Lev处理引起的phisD菌株的表型变化

图6 同义SNPs诱导氟喹诺酮耐药性中HisD的功能丧失

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.133849