一种双酶（CRISPR/Cas12a和Argonaute蛋白）介导的级联信号扩增且无需DNA提取的病原菌核酸检测方法

　　准确并尽早发现食源性病原菌感染在避免或减少感染风险方面起着关键作用。目前建立的许多分子核酸检测方法包括PCR，qPCR，以及环介导等温扩增等大多依赖于上游靶标的预扩增，其存在的非特异性扩增可能导致出现假阳性结果。而且，预扩增延长了检测时间，引物之间的干扰也可能限制后续检测。因此，建立无需DNA提取和扩增前处理的分子诊断方法以检测活的食源性病原菌对于限制这些病原菌对人类健康的有害影响具有重要意义。Cas蛋白和Argonaute(Ago)蛋白都是能够靶向识别的可编程性核酸酶。Cas蛋白独特高效的反式切割活性使得CRISPR/Cas成为具有优异灵敏度和选择性的核酸检测和诊断工具。然而，用于检测食源性病原菌的基于CRISPR/Cas12a的核酸生物传感器通常依赖于DNA预扩增。PfAgo在5’磷酸化引导DNA(P-gDNA)的引导下激活后，可以高特异性地切割目标DNA的一条链，剪切位点位于与引导序列互补的5′端开始的第10和第11个核苷酸之间，剪切不受靶标序列和剪切位点相邻序列限制。与CRISPR/Cas体系的高效剪切活性相比，PfAgo具有更好的选择性剪切活性。基于此，陈翊平教授课题组将CRISPR/Cas12a高效的反式剪切活性与PfAgo的特异性剪切优势相结合，并利用噬菌体通过感染和裂解细胞来识别和消灭活细菌的特性，建立了一种双酶介导的级联信号扩增(DECA)方法用于检测活的鼠伤寒沙门氏菌，而无需DNA提取和扩增。

　　如图1.噬菌体特异性捕获和裂解活的目标菌以释放DNA，从而使这一过程无需提取DNA。Cas12a与crRNA预结合形成Cas12a-crRNA二元复合物。在目标菌DNA存在的情况下，一个互补序列与crRNA结合并激活Cas12a，然后对单链DNA(ssDNA1)进行不加区分的非特异性切割。在这一过程中，生物素标记的ssDNA1首先偶联到磁性纳米颗粒(MNPs)表面，然后，链霉亲和素标记的碱性磷酸酶偶联物(SA-ALP)通过生物素-链霉亲和素亲和作用结合到MNPs表面。大量的ssDNA1-ALP生物偶联到MNPs表面，可以被激活的Cas12a快速降解。通过磁分离后，MNPs表面的ALP含量降低。由于ALP具有高效的去磷酸化催化活性，剩余的ALP可以使部分P-gDNA去磷酸化，导致PfAgo结合量不足。P-gDNA的浓度决定了激活的PfAgo的数量，激活的PfAgo能够剪切荧光报告分子，因此，荧光信号强度取决于活的目标菌的浓度，读出信号经过了级联放大。

　　图1 双酶介导的级联信号扩增法检测鼠伤寒沙门氏菌的策略和工程流程。首先利用噬菌体提取目标DNA，随后CRISPR/Cas12a复合体与DNA结合，激活Cas12a的反式切割活性，导致MNPs表面的ssDNA1-ALP被降解。经过磁分离去取游离的ALP后，剩余的ALP使P-gDNA去磷酸化，P-gDNA的浓度决定了PfAgo对荧光报告子的剪切水平，因此，输出荧光信号强度与致病菌DNA浓度有关。

　　将建立的DECA方法用于25个随机购买的食品样本的测试，同时使用标准qPCR方法结果作为参考，筛选样品中鼠伤寒沙门氏菌的感染(图2)。两种检测方法的结果一致，呈线性关系。因此，本研究建立的DECA方法为检测真实样本中的食源性致病菌提供了一种高灵敏度、特异性和有效性的方法，促进了食品安全。与qPCR方法相比，DECA不需要DNA提取或扩增步骤，降低了运行测试相关的成本。此外，qPCR不能区分病原菌是否存活，并可能表现出一些非特异性扩增，导致假阳性结果，而DECA不会。

　　图2 应用DECA和qPCR检测5种食品样本中的鼠伤寒沙门氏菌。(A)DECA和qPCR的定量检测结果;(B)DECA和qPCR结果的相关性分析。

　　本研究首次使用Cas12a和PfAgo双酶构建了一种超灵敏的生物传感器用于检测不同食品样本中活的病原菌，而无需核酸提取和DNA扩增，检测灵敏度可达23 CFU/mL。然而该方法目前仅限于实验室，不能用于现场检测，进一步的研究将致力于现场智能分析设备和快速便携式检测设备的研发。

　　论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c06530