基于CRISPR/Cas13a的金黄色葡萄球菌mecA药基因检测方法的建立

摘要

【目的】针对目前耐药基因检测通常需要依赖专业检测设施和设备，仍缺乏耐药基因快速检测方法这一问题，旨在建立一种基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) mecA耐药基因快速检测方法。【方法】首先在mecA基因序列的保守区中设计筛选出灵敏度较高的重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)引物和CRISPR RNA (CRISPR RNA, crRNA)，通过结合消线法核酸检测试纸技术(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)建立针对mecA基因的检测方法，最后利用模拟样本及临床分离样本对建立的新方法与传统方法进行比较。【结果】成功筛选出了1组针对mecA耐药基因的高效扩增引物和crRNA，并建立了基于CRISPR-ERASE的mecA耐药基因高灵敏核酸检测方法，最低检出限为10 copies/μL，在32株临床分离的金黄色葡萄球菌中，该方法共检出24株mecA耐药基因阳性菌株，与药敏试验及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测结果符合率为100%。【结论】建立了一种基于CRISPR-ERASE核酸检测试纸技术的简单、高灵敏的mecA耐药基因检测方法。

图1  ERASE核酸检测试纸原理示意图

图2  mecA基因CRISPR检测方法流程图

图3  引物及crRNA设计与筛选

图4  RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的灵敏度评价

图5  RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的特异性评价

图6  细菌样本评价

讨论与结论

MRSA可以导致严重的血液感染、皮肤和软组织感染、假体关节感染、脓毒症和肺炎    等[19-21]，仅2019年这种耐药菌就导致超过10万人死亡[22]。目前，MRSA的检测方法主要是药敏试验和荧光定量PCR。临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[23]对细菌药敏试验有明确的操作要求和判断标准，然而这种基于常规培养的方法耗时过长，并且容易受样本中其他细菌的影响，导致结果出现假阴性。研究人员利用荧光定量PCR技术检测患者痰液样本中的MRSA[24]，研究结果显示，荧光定量PCR法要比药敏试验快12–48 h。但是荧光定量PCR技术需要依赖专业的荧光检测设备。为了解决以上2种方法存在的问题，本研究基于CRISPR/Cas13a建立了一种针对mecA耐药基因的核酸检测方法。该方法可检测出10 copies/μL的mecA基因，比荧光定量PCR更加灵敏，且具有良好的特异性。此外，相较其他方法，CRISPR- ERASE方法能够更加方便、快捷地对细菌耐药基因进行检测。

对于CRISPR核酸检测系统，使用免疫层析试纸代替荧光检测仪器来判读CRISPR系统检测结果是实现方便、快捷检测的关键。然而，现有的CRISPR核酸检测试纸在检测阴性样本时，存在由主观判读导致假阳性的风险，而ERASE核酸检测试纸采用类似“竞争法”的消线法判读方式，即以Ｔ线完全消失作为阳性判断标准，一定程度上降低了主观判读带来假阳性的风险，提高了检测的特异性，且灵敏度相比传统的CRISPR核酸检测试纸提高了10倍[15]，该试纸同样用在了我国首个获批上市的CRISPR诊断试剂中(国械注准20203400919)。

综上所述，本研究基于CRISPR技术，同时结合了ERASE核酸检测试纸，可以降低对专业检测仪器设备的依赖，更加方便、快捷地进行细菌耐药基因检测。在预防耐药细菌的传播、实时监测细菌耐药进展等方面有很大的发展前景。但是，该方法还存在不足之处。与目前大部分的细菌核酸检测方法相同，在检测之前需要提取细菌样本中的核酸，而目前细菌核酸的快速提取通常需要依赖离心机或磁力架等设备，增加了检测过程的复杂程度。因此，未来该方法在下一步转化应用过程中应着重突破样本快速前处理技术，进而实现直接对潜在污染样本的快速检测。目前，研究人员正在不断探究快速提取细菌DNA的新方法，后期随着快速提取试剂的改进与优化，以及便携式加热设备的研发。这些关键技术的突破将为临床早期发现耐药基因，及时制定及调整治疗方案提供一种新方法，也将为防控细菌耐药提供新的策略。