通过全基因组测序和宏基因组测序直接预测铜绿假单胞菌的碳青霉烯类耐药性

原创

来源：邹晶晶

2024-05-21 08:35:14

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核心提示：该研究证明了通过直接检测碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的关键基因特征预测其耐药表型的可能性，有助于及时治疗和监测碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌。

　　碳青霉烯类耐药是耐药铜绿假单胞菌感染管理中的一个主要问题。直接根据基因型预测其碳青霉烯耐药表型，有助于促进及时的抗生素治疗。不过，由于铜绿假单胞菌复杂的碳青霉烯耐药机制和变异驱动的碳青霉烯耐药的高流行率，基因型预测耐药表型策略备受挑战。基于此背景，Liu等人利用WGS对1622株铜绿假单胞菌进行测序，结合机器学习，分别筛选出铜绿假单胞菌对亚胺培南(IPM)和美罗培南(MEM)耐药的16和31个关键基因特征，构建了耐药预测模型;并基于此耐药模型，对所收集的72例临床铜绿假单胞菌阳性痰液样本进行宏基因组(MGS)测序后预测铜绿假单胞菌的碳青霉烯类耐药表型，其阳性预测值(PPV)分别为0.897(IPM)和0.889(MEM)。该研究证明了通过直接检测碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的关键基因特征预测其耐药表型的可能性，有助于及时治疗和监测碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌。

　　碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌(CRPA)是耐药铜绿假单胞菌(P.ae)感染管理中的一个主要问题。直接根据基因型预测其碳青霉烯耐药表型，有助于促进及时的抗生素治疗。然而，复杂的耐药机制阻碍了碳青霉烯类耐药基因型对表型的预测。基于此，Liu等人探讨了WGS和MGS在CRPA表型上的预测价值。在研究内容上，作者首先获得了1622株临床P.ae纯培养物的耐药表型(纸片扩散法和肉汤稀释法)，然后进行WGS测序并通过机器学习将耐药基因型与表型进行匹配，建立预测模型。这些菌被随机以4:1的比例分成训练集和验证集，以筛选出碳青霉烯类耐药相关的关键基因特征(图1)。研究将分离株中与碳青霉烯耐药相关的基因变异以及变异类型(GVARs)进行了评价，如图2所示，在所有GVAR组中oprD变异组具有较高的影响效应，oprD(HIGH)拥有最高的阳性预测价值(PPV)，且是唯一一组整体PPV≥0.9的GVAR。以PAO1为参考菌株，IPM数据集的PPV为0.970(163/168)，MEM数据集的PPV为0.943(346/367)。另外，当引入另外7株参考菌株，oprD(HIGH)数量增多，IPM数据集和MEM数据集的PPV分别变为0.963(209/217)和0.939(419/446)。因此，oprD(HIGH)组被选为碳青霉烯耐药预测的候选关键GVAR特征。为了选择精确的机器学习方法，作者也对LASSO、RF、FNN、SVM和XGBoost构建的预测模型进行了比较。结果显示，LASSO构建的预测模型优于其它机器学习方法构建的预测模型，且当前的IPM或MEM数据集样本量足以提供一个稳定和可重复的AUC(图3)。根据训练集和LASSO回归，分别选择了16个和31个关键基因特征应用于IPM和MEM的碳青霉烯类耐药预测(表1.图4 A)。此时，IPM耐药预测模型的AUC为0.906.敏感性为0.820.特异性为0.977.MEM耐药性预测模型的AUC为0.925.敏感性为0.902.特异性为0.878.在验证集上，IPM和MEM电阻预测模型的auc分别为0.887和0.888.在这里，也观察到当以8株野生型菌株作为参考菌株，而不是单独的PAO1作为参考菌株来鉴定oprD变异时，两种预测模型的性能均能进一步改进(图4B)。随后，作者利用不同测序长度和基因深度的短读序列(NGS)和长读序列(ONT)评价预测模型的数据读取性能。结果显示，预测模型的AUC随着测序深度或基因组覆盖率的增加而增加，并在约10×的测序深度和95.5%的基因组覆盖率时变得稳定。另外，与长读序列(ONT)相比，短读序列更有利于碳青霉烯抗性预测(图4C)。文章的目的是建立一个预测模型并直接应用于临床样本，于是作者首先选用30例P.ae阳性痰液样本用于评估MGS是否能够通过检测这些关键基因特征完成CRPA的预测。在这里，作者选用了2种MGS(基于NGS的和基于ONT的)。结果显示，在检测GPA方面，基于NGS的MGS和三代测序结果一致;但在检测GVARs方面，基于NGS的MGS具有明显的优势：ONT存在假阳性(图5)。这说明NGS在MGS预测痰中铜绿假单胞菌碳青霉烯类耐药性方面优于ONT。因此，作者进一步收集了42份痰标本，进行基于NGS的MGS，以评价其在碳青霉烯耐药预测中的性能。在这72例样本中，65.0%(26/40)对IPM - R/I的P.ae被正确预测，PPV为0.897.63.2%(24/38)的MEM - R/I的P.ae被MGS正确预测，PPV为0.889(表2)。

　　总的来说，文章利用1622例分离株和72例临床样本探讨了WGS和MGS在直接预测P.ae碳青霉烯耐药中的适用性，明确了研究oprD变异机制在P.ae碳青霉烯耐药性预测中的重要性。不过，文章也存在一些局限性。第一，为了简化预测模型，作者首先通过PPV和频率筛选候选基因特征，然后再通过机器学习进一步筛选，这样的筛选过程过滤掉了低频率和共相互作用的基因特征，可利用卷积神经网络解决。其次，也需要识别出更多新的基因特征，以提高模型的预测价值。第三，该研究中的碳青霉烯耐药表型根据CLSI 2021指南进行了分类，因此在未来推荐新的断点时，模型可能需要进行更新。

　　图1 1622株P.ae的系统发育、地理和抗性表型分布。由内到外的五个圆圈代表1622株P.ae的系统发育树、国家分布、IPM耐药表型、MEM耐药表型以及本研究的训练和验证集分布。

　　图2 根据高、中、低效应影响分类的ppv和GVARs的分布。(A)不同GVARs的高、中、低效应影响组的ppv。oprD_PAO1或oprD_PAO1+表示PAO1单独或包括PAO1在内的8株菌株存在的oprD变异。(B和C)oprD(HIGH)组中每个GVAR的ppv。(D和E)oprD(HIGH)和每个GVAR在oprD(HIGH)组中的分布。蓝色短线表示P.ae分离株中存在oprD(HIGH)变异。