表面增强拉曼散射法实现耐药菌的免培养多重检测

快速、准确地检测细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，对于临床告知最佳的治疗方案和避免滥用抗生素至关重要。Dai等人基于表面增强拉曼散射技术(SERS)开发了一种免病原培养的检测方法，通过2种特异性探针实现表达广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的检测，检测限可低至103 CFU/mL。另外，结合便携式拉曼显微镜，此技术还可在不影响灵敏度和特异性的情况下将病原筛选周期缩短至1.5小时。

美国疾病控制中心(CDC)指出：由ESBLs产生引起的对β-内酰胺类抗生素的多重耐药(MDR)菌严重威胁公共卫生健康。目前，临床上对产ESBL的肠杆菌的金标准诊断方法仍然是基于培养的耗时方案，无法提供及时的治疗方案。为缩短检测周期，近年来发展了不少分子检测技术，尤其是基于PCR的检测面板，已被商业化应用。不过，这种基于核酸检测的方案易出现假阴性，因为不断衍生的耐药机制并不完全可知，检测面板中并不包含新出现的突变。当然，也发展了不少生物传感器，包括电化学、生化分析等，尽管这些技术均能够有效缩短检测周期，但它们的检测限通常偏高。基于此背景，Dai等人基于SERS开发了一种二重检测技术应用于产ESBLs的临床细菌的诊断。此技术设计了2种拉曼探针(SERS标签，R1G和R3G)：包括一个β-内酰胺酶识别单元和一个硫醇化合物。当检测体系内不存在β-内酰胺酶，SERS标签上的硫醇基团不会与纳米金颗粒(AuNPs)相互作用，没有信号。反之，当体系内存在β-内酰胺酶时，硫醇基团会被释放并与AuNPs结合，产生拉曼信号。作者设计了2种β-内酰胺酶识别单元(与相应的拉曼标签配对)，由此来实现2种产β-内酰胺酶细菌的检测。在这里，作者分别选用2种硫醇化合物：4-ATP(振动信号：1078cm−1)和2-ATP(振动信号：1024cm−1)应用于二重检测(图1)。

文中，考虑到SERS信号的增强作用与AuNPs形状有关，作者采用种子生长法合成了四种不同形状的AuNPs：球形、板形、杆状体，并利用这些AuNPs探索了4-ATP的线性范围。结果显示，在4-ATP的特征峰中，C−S(1078cm−1)伸缩振动强度最大。在此波长下，4种形状AuNPs均能够在4-ATP存在下产生拉曼信号，且在浓度范围(0-1.41 μM)内具有线性。在这里，也能观察到，星状AuNPs能够最大化增强SERS信号(图2)。这种信号放大可以解释为在尖锐的边缘或顶点的位置电磁场最大。然后，作者评估了R1G和R3G对多种β-内酰胺酶的敏感性，包括：青霉素酶(TEM-1)，AmpC型头孢菌素酶(AmpC)，ESBLs(CTX-M-15)和碳青霉烯酶(L1.KPC-2)。结果显示，R1G和R3G在与AmpC、CTX-M-15、L1、KPC-2和KPC-3孵育时均产生了显著的拉曼信号，不过R3G的拉曼强度几乎没有随着TEM-1浓度的增加而增加，表明其不能水解一代抗生素。R1G和R3G对CTX-M-15的灵敏度最好，检测限分别为10pM和1 pM(图3 a-b)。另外，作者也观察到当R3G和CTX-M-15与星状或者球状AuNPs孵育时，颜色会有显著的颜色变化，这显示了方法的比色可行性。为进一步提高方法的定量性能，作者引入了比率强度的概念，将Au的特征峰(1374cm−1)作为参考峰，该峰的强度会随着分析物数量的增加而减小。如图3 c-f所示，这种比率强度改善了线性相关性，检测限得到了提高，所有R2值均高于0.97.随后，作者将该方法应用于活细菌样品中的β-内酰胺酶活性检测，包括临床分离物：阴沟肠杆菌/AmpC、大肠杆菌/CTX-M，肺炎克雷伯氏菌/KPC，阴沟肠杆菌/IMI，大肠杆菌/NDM;工程菌：大肠杆菌/TEM-1和大肠杆菌/IMP-1.结果显示，R1G和R3G与这些临床分离株或工程菌孵育时，在1024或1078 cm−1时SERS强度显著增加。R1G检测到了阴沟肠杆菌/AmpC、大肠杆菌/CTX-M、肺炎克雷伯氏菌/KPC、阴沟肠杆菌/IMI和大肠杆菌/TEM，检测限分别为：103.104.104.104.105 CFU/mL。R3G对产ESBL/AmpC和碳青霉烯酶类细菌具有选择性，对产碳青霉烯酶的细菌和大肠杆菌/CTX-M的检测限为104 CFU/mL，对AmpC的检测限为105 cfu/mL(图4)。此结果显示了方法的优越性，可与最先进的商业ESBL筛选技术相媲美(CDC设定的最低检出限为105 CFU/mL)。最后，作者试图改进方法使之能够应用于资源有限的环境中。首先，作者将原本的500 μL分析体积缩减至10 μL，提高了检测限(50 nM到2 nM)。这是因为在原来的研究方案中，商业的拉曼光谱仪仅能检测到比色皿中500 μL溶液中的一小部分，而改进的方案将500 μL溶液浓缩成10 μL后借助拉曼显微镜观察，此浓缩提高了检测限(图5 a)。在这里，作者也利用连续稀释(103−106 CFU/mL)的多种细菌悬液表征了此方法的定量分析能力和双重筛选能力(图5)，检测限为103 CFU/mL，总分析时间为1.5 h。

总的来说，研究系统地证明了基于便携式拉曼显微镜进行产β-内酰胺酶耐药菌定量筛选方案的可行性，此方案免除了常规的病原培养，将全流程分析时间缩短至1.5 h，且成本较低，有助于临床减少经验性碳青霉烯类抗生素处方，推进感染病原精准治疗进程。

文章DOI： DOI: 10.1021/acssensors.3c01345

图1 SERS传感器检测β-内酰胺酶抗性的反应原理。当存在对第一代头孢菌素产生耐药的β-内酰胺酶时，R1G会被水解并释放一种SERS标签与AuNPs结合。当存在对第三代头孢菌素产生耐药的β内酰胺酶时，R1G和R3G会被同时水解并释放2种SERS标签与AuNPs结合。

图2 AuNPs的表征及其对4-ATP的拉曼检测。(a)AuNPs的电子显微镜示意图;(b)不同形状AuNPs的吸收光谱及其水溶液的光学图像。(c)星状的AuNPs与不同浓度的4-ATP(0−1.41μM)在室温下孵育1小时的拉曼光谱。星状的AuNPs在最大吸光度(612 nm)下的光密度(OD)被校准为1.5.(d)不同AuNPs作用下4-ATP的校准曲线。绘制了4种不同形状AuNPs与不同浓度4-ATP(0-1.4 μM)室温下孵育1小时后在1078 cm−1处的拉曼强度(最大吸光度下的最终OD为1.5)。误差条表示标准差(n = 3)。

图3 R1G和R3G对不同类型的内酰胺酶的敏感性。(a，b)将25 μM R1G或R3G与不同浓度的CTX-M-15、TEM-1、IMP-1、L1、KPC-2(1 pM、10 pM、100 pM、1000 pM和10 nM)和星状AuNPs(最终OD = 1.5)在25 ℃下孵育1小时。a.u.表示相对光强度。(c，d)拉曼信号(R1G为1024cm−1.R3G为1078cm−1)除以AuNPs星的固有峰(1377cm−1)的比值分析。误差条表示标准差(n = 3)。黑色横线表示空白样品的平均值(Au纳米星仅孵化R1G或R3G)，灰色横线表示空白样品上的标准差。(e，f)使用强度或比率分析的线性回归曲线的R2值。

图4 R1G和R3G对不同细菌的敏感性。浓度从103到107 CFU/mL的阴沟肠杆菌/AmpC、大肠杆菌/CTX-M、肺炎克雷伯氏菌/KPC、大肠杆菌/NDM、阴沟杆菌/IMI、大肠杆菌/TEM-1*和大肠杆菌/IMP-1*与25 μM R1G (a)或R3G(b)孵育1 h后的比率强度。*表示为工程细菌。误差条表示标准差(n = 3)。黑色横线表示空白样品的平均值，灰色横线表示空白样品上的标准差。

图5 基于拉曼显微镜的多重耐药菌检测。(a)基于便携式拉曼显微镜的检测工作流程。菌悬液与R1G、R3G和AuNPs孵育1 h后，用0.22 μm的注射器过滤器过滤悬浮液混合物以去除活菌，然后离心，得到10 μL的浓缩AuNPs并转移至疏水载玻片上并立即进行拉曼测量和分析。(b，c)基于Horiba LabRAM拉曼显微镜的细菌定量能力表征。(d，e)使用之前发表的低成本便携式拉曼显微镜同时筛选两种产不同β-内酰胺酶的细菌。105 CFU/mL的大肠杆菌/TEM-1.阴沟肠杆菌/AmpC和大肠杆菌/CTX-M与107 CFU/mL的大肠杆菌按图d中的图例进行混合后与R1G和R3G孵育后所得的SERS光谱图(d)。(e)在1024和1078cm−1处的拉曼强度分别对应于2-ATP和4-ATP的拉曼特征。*表示为工程细菌。