在离心微流控芯片中实现核酸提取和检测一体化

本课题对壳聚糖修饰磁珠衍生核酸提取方法进行改进，将该方法集成到离心微流控芯片中，进行基于LAMP的实时荧光检测。初步制备了壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒，并验证了其在特定pH条件下对核酸的吸附和解吸能力。在此基础上，探索了一种pH控制的核酸提取优化工艺。随后，我们开发了离心微流控装置，并在芯片中实现了改进的提取方法，实现了一个简单、快速和自动化的检测系统。为了评估检测性能并验证我们系统的多功能性，我们针对高危HPV进行了基于LAMP的实时荧光检测。实验结果表明，该离心微流体核酸检测系统具有通用性、便捷性、集成化、高通量、短时间、高性价比等优点。

用于诊断的核酸检测或核酸扩增检测通常被称为NAT。传统的传染病NAT几乎都是在集中实验室中使用高端仪器和熟练人员进行的，这导致了低通量和医疗设施的巨大负担。随着微流控芯片技术的发展，操作简单，自动化程度高，使得NAT技术在快速高效分析、低消耗、高通量和小型化等方面表现出了良好的前景。

为了在生物医学和临床诊断应用中实现操作简单和样本即答的目的，有必要将核酸提取、扩增和检测集成到离心微流体系统中。不幸的是，核酸提取步骤很少集成到微器件中，因为它需要复杂的过程，耗时很长。同时，核酸提取是NAT的初始和必要步骤，纯化核酸的质量主要决定后续检测的结果。

为了获得最佳结果，最近的策略倾向于依赖DNA和磁珠修饰表面之间的静电吸引。其中，壳聚糖和聚多巴胺改性磁固相萃取具有良好的生物相容性，越来越适用于基因组DNA的提取。这些方法通过静电吸附和pH值控制解吸来提取核酸。整个过程没有使用有毒的化学试剂或扩增抑制剂，有助于建立一个友好的分析环境、低成本和快速完成时间。然而，这种pH响应方式需要精确管理溶液的pH值和磁控制，这很难纳入一个检测系统，到目前为止，还没有成功集成到离心微流体检测系统中进行有效的核酸提取。

壳聚糖是一种流行的生物相容性和低成本的生物聚合物。它由氨基组成（pKa为6.2至7.0），这些氨基能够完全质子化并溶解在pKa低于6.2的酸中。因此，通过降低pH值，带负电的核酸很容易通过静电相互作用吸附到带正电的壳聚糖修饰的磁性微球表面。壳聚糖在稍高的pH值（如9.0）下恢复为中性电荷并释放核酸。同时，壳聚糖具有亲水性，导致其对蛋白质的吸附倾向较低，蛋白质是核酸提取中的主要杂质之一。

选择了尺寸较小的磁性微球，以获得更高的表面积与体积比和更强的磁响应，这有利于壳聚糖修饰和核酸吸附。

Chelex-100是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的阳离子螯合树脂，配对的亚氨基二乙酸离子作为螯合基团，协助吸附非核酸污染物此外，而螯合金属离子有望保护DNA，防止其降解。

图1 壳聚糖修饰磁性微球提取核酸的原理

离心微流控芯片设计包括五个部分，每个部分包括:样品裂解室、提取室、转移通道、LAMP鸡尾酒库、阻塞室、对称结构、8个反应室和一个废物室。该芯片的衬底为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，由于其优异的可加工性和光学透明度而被广泛应用。芯片结构采用Auto CAD 设计迭代，集核酸提取、扩增、检测于一体。同时，选择压敏胶(PSA)箔层作为密封层，在不影响扩增和检测的情况下，有效防止试剂泄漏。最后，在芯片通风口的准确位置为PSA层打孔。

图2 离心式微流体装置的制造与运行

图3 离心式微流体装置工作示意图

将LAMP引入到我们的微流体装置中，并在完成表征后，对其检测性能进行了广泛的评估。检测项目包括5种高危HPV (HPV16、HPV18、HPV39、HPV45、HPV52)，都是宫颈癌和其他肛门生殖器癌的关键致癌因素。出于安全性考虑，采用HPV质粒和HeLa细胞作为阳性样本。从特异性、稳定性和持续时间三个方面评价检测性能。结果显示，当样品与引物组相对应时，出现了代表阳性反应的强烈荧光信号，其强度是阴性反应的5 - 10倍。

本文在离心微流控系统上实现了核酸的提取、扩增和检测一体化。微流控系统采用壳聚糖改性磁性微球作为固相萃取材料，Chelex-100作为纯化助剂，成功实现了PH诱导的核酸提取，避免了有机溶剂和酸性溶液对后续工艺产生不利影响。此外，LAMP鸡尾酒还可以作为核酸脱附的洗脱剂，大大简化了整个过程。通过离心力和外磁控制，将样品和试剂分发到所需的室中，实现了简单、自动化的核酸检测。

参考文献：Zhao X, Huang Y, Li X, Yang W, Lv Y, Sun W, Huang J, Mi S. Full integration of nucleic acid extraction and detection into a centrifugal microfluidic chip employing chitosan-modified microspheres. Talanta. 2022 Dec 1;250:123711.