一种人工智能辅助智能手机的基于细菌分泌的透明质酸酶的快速、 灵敏、可视化细菌检测方法

致病菌的许多细胞外产物具有组织损伤作用，其中透明质酸酶（HAsse）作为细菌的传播因子，能够降解细胞外基质中的底物透明质酸（如HA），促进宿主组织的侵袭。相当多的研究表明，Haase的产生与细菌的类型有关。例如，与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌会产生更多的Haase，这使得Haase成为区分革兰氏阴性菌和阳性菌的潜在生物标志物。相比于其他理化指标检测，细菌HAase具有特异性提高，样品处理过程简化等明显优势。

本研究开发了一种人工智能（AI）辅助的基于智能手机的比色生物传感器，通过测量细菌分泌的透明质酸酶（HAase）来可视化、快速、灵敏地检测致病菌。该生物传感器由负载氯苯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）的透明质酸（HA）水凝胶作为生物反应器和负载β-半乳糖苷酶（β-gal）的琼脂水凝胶作为信号发生器组成。细菌Hasse首先以浓度依赖方式降解生物反应器，随后影响CPRG的释放，CPRG可以进一步与固定在琼脂水凝胶中的β-gal反应生成不同的颜色信号。使用智能手机捕捉颜色信号，然后利用自主开发的YOLOv5算法将智能手机采集的颜色信号与初始细菌浓度相关联进行分析。

图1 由HA水凝胶生物反应器和琼脂水凝胶信号发生器组成的AI辅助智能手机比色生物传感器示意图。（a）细菌种类和浓度的比色检测示意图，插图说明了生物反应器和信号发生器的制备；（B）使用YOLOv5算法采集和分析检测结果。

研究首先进行了生物传感器的构建和优化。首先，基于β-gal能够水解黄色底物CPRG生成氯酚红的性质，构建了负载CPRG的HA水凝胶作为生物反应器。如图2a所示，所有的反应最初都是黄色，在中等酶/底物浓度下，反应的颜色从黄色、橙色、红色和紫色不等。紫外-可见光谱（图2b）表明，随着β-gal的加入，CPRG在410 nm处的特征吸收峰逐渐消失，在570 nm处出现新的吸收峰。基于此优化了CPRG和β-gal的显色反应。然后，进行了不同细菌HAase产率的评价。图2c结果表明，4种代表性菌株分泌HAase浓度与细菌浓度呈线性相关。相比之下，在相同细菌浓度下革兰氏阳性菌的 HAase产率高于革兰氏阴性菌。因此，不同水平的细菌HAase可以作为区分革兰氏阴性菌和阳性菌的指标。进一步选择不同分子量的HA进行HAase降解，如图2d所示，高分子量和低分子量为8:1的HA复合材料对HAase最敏感，其降解程度与HAase浓度呈较强的线性关系，这一明确的关系有利于获得定量检测。将CPRG负载在HA复合材料中，然后在Ca²⁺存在下添加海藻酸钠形成水凝胶生物反应器。研究了不同类型和浓度的细菌对生物反应器的降解行为（图2 e），研究还表明生物反应器中CPRG的释放曲线也与水凝胶的降解高度显著相关（图2 f）。进一步优化了负载β-gal的琼脂水凝胶的信号发生器以及生物传感器的检测反应条件参数。在最佳条件下，分别测定构建的生物传感器在PBS和血清中细菌标准溶液检测的检测限（LOD）（图2 k）。

图2 生物传感器的特性。（a）CPRG和β-gal之间颜色反应的分析特征。（b）与β-gal（20μg/mL）孵育后不同浓度的CPRG的光谱变化。（c）不同浓度（10-10⁵ CFU/mL）的不同细菌的HAase产率。（d）由高（1500-2500 kDa）和低（7 kDa）MW制备的HA复合物（2 mg/mL）对HAase的敏感性。（e）用不同浓度（10-10⁵ CFU/mL）和类型（金黄色葡萄球菌和A 群链球菌作为G⁺，铜绿假单胞菌和大肠杆菌作为G^-）的细菌降解HA水凝胶生物反应器。（f）从具有不同浓度和类型细菌的生物反应器中释放CPRG。（g）负载β-gal的琼脂水凝胶信号发生器的HAase非响应性的表征和（h）反应方案。（I）负载β-gal的琼脂水凝胶与不同浓度的CPRG反应后的变色效应。（j-k）该生物传感器对以（j）PBS或（k）100%血清为溶剂的不同浓度细菌溶液的检测结果。

研究采用YOLOv5算法对生物传感器获得的结果进行精确分析，并将构建的传感器用于活菌的检测（图3）。结果表明，所提出的生物传感器能够正确检测活菌和死菌混合物中活菌的比例，避免了细菌可培养性的限制核死菌的干扰。进一步将传感器用于食品样品的检测，证明方法适用性。

图3 生物传感器在活菌检测中的应用。（a）制备具有不同百分比（20%-100%）活细菌（10⁴ CFU/mL）的细菌溶液。（b）生物传感器产生的图像结果。这些图像的灰度模式也显示出来，这是机器学习过程中的一个分类预测基础参数。（c）该生物传感器产生的定量结果。（d-e）检测食物样本中的细菌。（d）细菌污染的食物模型（蓝莓）的制备以及分别由建立的生物传感器和培养方法产生的检测结果。（e）该生物传感器产生的定量结果。（f-g）在抗菌药物敏感性测试中的应用，（f）分别由构建的生物传感器和培养方法产生的检测图像结果。（g）该生物传感器产生的定量结果。

之后研究考察了提出的生物传感器在药敏测试中的应用（图4）。将不同浓度的青霉素-链霉素溶液与4种典型细菌共孵育，利用所设计的生物传感器检测剩余活菌浓度。根据死亡细菌浓度与总细菌浓度的比率来评估细菌对抗生素的敏感性。结果表明所构建的传感器在执行药敏测试是具有0%的严重错误率（误诊为敏感菌株）和0%的主要错误率（误诊为耐药菌株），符合FDA严重错误率<1.5%，重大错误率<3.0%的要求，是一种快速、简单、有效的药敏测试应用程序。研究进一步将构建的生物传感器应用于脓肿中收集的12个样品，通过其敏感性和特异性测试等，评估其在临床应用中的潜力。

图4 检测临床样本中的细菌。（a）构建的生物传感器和培养方法的操作流程，分别用于检测临床样本中的细菌。（b）生物传感器检测到的12个样本和YOLOv5算法获得的结果输出。（c）我们的生物传感器和培养方法分别获得的结果。图中的绿色水平坐标表示“无细菌感染”。（d）构建的生物传感器和培养方法的接收器操作特征曲线。

总之，本研究提供了一种人工智能辅助的基于智能手机的比色生物传感器，通过测量细菌分泌的HAase来实现致病菌的即时检测。所构建的生物传感器可以在60分钟内实现10 CFU/mL的LOD，并区分PBS和血清中不同细菌种类和浓度。采用自主开发的YOLOv5算法对颜色信号进行分析，识别准确率较高（>92%）。所提出的生物传感器在食品样品中的细菌检测、抗菌药敏试验和临床病例细菌感染评估等方面均表现出优异的性能，具有广阔的应用前景。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116369