基于D型氨基酸代谢标记的病原菌抗生素药敏快检新方法

抗生素的误用、滥用促使了细菌耐药性问题不断升级，几乎耐所有抗生素的“超级细菌”数量也在不断上升。现今，细菌耐药性的发生和传播已引起了全球关注，并被世卫组织认为是本世纪最大的公共卫生安全问题之一。药敏测试（Antimicrobial susceptibility test，AST）是当前指导抗生素最常用，也是最有效的方法。此技术可通过揭露抗生素对病原体的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentrations，MICs）实现临床精准用药的同时减少细菌耐药传播。然而，传统的AST技术仍然是基于细菌增殖，往往需要至少16-18 h去获得一定量的细菌密度（10⁶到10⁸ CFU/mL），如微量肉汤稀释法和纸片扩散法。此必要的增殖过程延长了结果报告周期，无法及时地为临床提供药敏信息。近年来，已发展了不少新型AST技术，其中，基于拉曼的AST技术获得了广泛关注。此技术通过测量细菌利用重水或同位素标记的葡萄糖数量以监测细菌的代谢活动，实施起来相对简便、准确，但由于检测速度慢，且与医院常用仪器的兼容性差，其应用受到了限制。唯二获批用于临床的均为基于实时显微镜的新型AST技术，可通过细菌形态变化成像来确定MIC值。但这种技术具有较高的设备要求（成本高），很大程度上阻碍了其进一步广泛使用。因而，发展一种快速且实用的AST技术以可靠地获得细菌准确的药敏结果仍是当前的一大需求。基于此背景，上交杨朝勇团队提出了一种基于FDAA标记的FaAST技术，通过流式细胞仪测定FDAA的标记强度，分析在抗生素作用时细菌的代谢情况以确定相应的MIC（图1）。

FDAA标记策略能够反应细菌的代谢情况已在先前研究中得以证明，但是否能用于本研究，尚需证明。为此，作者首先利用ESKAPE中的3种细菌：大肠杆菌（Ec）、粪肠球菌（Ef）和金黄色葡萄球菌（Sa）及2种抗生素：红霉素（ERY）和左氧氟沙星（LEV）对此标记策略可行性进行验证。在这里，作者分析了每个物种的敏感菌和耐药菌与不同剂量的抗生素及0.3 mM FDAA共孵育2 h后的荧光强度变化。结果如图2A所示，尽管不同细菌对不同类型的抗生素显示出了不同的FDAA标记变化模式，但FaAST-MIC与BMD-MIC一致，这表明此标记策略具备区分敏感和耐药菌，且提供准确的MIC值的能力。另外，作者还用荧光共聚焦显微镜对此标记强度趋势进行了再次验证（图2B）。不过，在这里，作者也观察到了某些非典型的高荧光，原因可能是FDAA非特异地标记了死亡细菌。尽管存在这种个例事件，但是鉴于流式分析中会分析到15000个荧光事件，作者认为MIC值不会因此受到显著干扰。因而，FaAST技术具备通过检测不同剂量抗生素作用下FDAA标记强度继而可靠地检测细菌对药物的代谢反应的能力。

随后，作者对FaAST的反应体系和方法进行优化，确定了工作流程：PBS（1:10）稀释细菌样品后进行流式分析；共孵育时间：2 h；FDAA工作浓度：0.15 mM；细菌接种量：10⁷ CFU/mL。基于此优化结果，作者首先试图应用于MRSA的检测，这是因为MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药机制是：药物诱导细菌产生青霉素结合蛋白PBP2a，而这种“诱导”可能会使“共孵育时间：2 h”并不实际。在这里，作者利用FaAST测定了6株MRSA和4株MSSA对苯唑西林的MIC值，结果与BMD基本一致（表1），能够实现敏感菌和耐药菌的准确区分。但是，作者也观察到一株MRSA标准株ATCC 43300测定的MIC值相较于BMD-MIC会低2倍，且共孵育时间需要延长至7 h；另外，一株敏感菌Sa398的FaAST-MIC值明显高于BMD-MIC，且被错误鉴定为耐药株。对此，作者给出的解释是：ATCC 43300在被诱导时产生的PBP2a蛋白量较少（mecA基因表达量较少）；而Sa398则可能是具备其它耐药机制（图3）。总的来说，除少数MSSA菌株和MRSA菌株外，FaAST可在3 h内轻松、准确地测定大多数Sa的MIC值。

进一步，作者引入更多的ESKAPE菌株，包括Ec、Pa、Ef、Sa的标准株及临床敏感和耐药株；另外，研究的菌株中包含了产β-内酰胺酶的Ec（Ec13）、耐碳青霉烯类的Pa（Pa13）、Ef（Ef28）、鲍曼不动杆菌（Ab，Ab16）及肺炎克雷伯（Kp，Kp9）。对整个检测面板（97种抗生素-细菌组合）的检测结果显示：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的MIC值一致性（比率<2）分别占所有试验的90%和85%，其中革兰氏阳性菌FaAST-MIC与BMD-MIC一致率为0.936，革兰氏阴性菌FaAST-MIC与BMD-MIC一致率为0.911。另外，所有细菌的FaAST结果分类一致率（CA）为98.13%，轻微、主要和非常主要的分类错误分别为0.93%（图4中突出显示）、1.47%（Sa398与苯唑西林）和0。这些分类结果满足FDA对新AST技术的要求：CA≥90%；三种错误率分别为：≤10%，≤3.0%和≤1.5%。因此，FaAST具备可靠检测医院内关键菌的MIC值的能力，且对一种菌（~100种药物-细菌组合）的MIC值确定时间能够压缩在3 h，成本约为30元，或能成为一种临床实用性工具。

为验证FaAST的临床适用性，作者利用25例来源于HAP患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）：9例Ab，6例Kp，3例Pa，1例产气克雷伯，1例阴沟肠杆菌和5例阴性感染样本（无任何感染）与抗生素及FDAA共培养6 h后进行流式分析，分析7000至10000事件。在这里，共检测了100种抗生素-细菌组合，CA率为86%，次要和主要错误分别为4%和10%，尚未观察到极主要错误，如图5所示。这项初步研究证明了FaAST在9 h内可靠地评估对BALF样本的抗生素敏感性的潜力，说明了方法的时间优越性，有助于实现危重患者人群的精准用药。

综上，作者基于定量分析细菌细胞代谢状态的荧光代谢标记策略，开发了一种快速、准确、实用和通用的AST方案。该策略利用FDAA标记细菌以准确定量细菌的生长代谢活性；细菌的代谢会在受到外界抗生素攻击时展现出对应的变化：低剂量时急剧下降（敏感菌）和高剂量时“不情愿地”下降（耐药菌）。所采用的流式分析设备是目前医学实验室较为常见的设备，相较于拉曼设备，本方法推广潜力更强。另外，本方法能够应用于实际样本，且是来源于HAP的BALF样本（阳性判定标准：10⁵ CFU/mL），在9 h内能较为准确地给出约100种抗生素-细菌组合的MIC值，这为指导临床精准用药具有非常重要的实际应用意义。相较于以往的一些研究，本方案具有一些显著性优势，譬如：第一，基于流式细胞术对大量单个细菌细胞代谢反应的分析，可以避免出现（荧光/光学）显微镜观察中因细菌形态变化导致MIC值不确定/难确定的问题，以及仅观察少数细菌带来的缺乏代表性的问题；第二，FDAA荧光标记策略的优越性，避免了同位素标记底物时存在的低信噪比（背景信号较高）、以及相较于其它荧光标记策略的灵敏性和普适性。

图1 FaAST的工作原理和工作流程。将FDAA探针（Cy5ADA）与细菌及不同浓度的抗生素进行共培养（2 h），随后利用流式细胞仪对FDAA标记进行定量分析。当与耐药菌进行共培养时，仅当使用到高剂量的抗生素时，FDAA标记荧光强度会下降；当与敏感菌共培养时，低剂量的抗生素即可显著降低荧光强度。因而，可通过相应的FDAA荧光标记曲线来确定药物的MIC值。

图2 FDAA的标记准确地揭示了细菌对不同浓度抗生素的代谢反应。A）不同细菌在用不同浓度的抗生素处理时展现出来的不同的FDAA标记强度变化趋势。细菌、抗生素和FDAA在共孵育2 h后，利用流式细胞仪分析细菌的荧光强度。图中，敏感菌显示较低的MIC值，而耐药菌显示较高的MIC，且MIC值与BMD获得的试验值一致。B）FDAA标记的敏感菌和耐药菌的荧光共聚焦显微镜成像。敏感菌和耐药菌的FDAA标记强度的变化趋势同流式分析仪获得的趋势一致。

图3 苯唑西林治疗下Sa的FDAA标记反应。大多数以苯唑西林敏感（A，Sa24为例）和耐药Sa（B，Sa22为例）在使用抗生素处理时呈现典型的FDAA标记曲线，并识别出准确的MICs。MRSA标准菌株ATCC 43300在与苯唑西林共培养7-8小时后才显示出耐药的FDAA标记表型（C-D）。与苯唑西林共培养时敏感菌株和耐药菌株的mecA基因表达量（E-F），从中可以看出敏感株对苯唑西林攻击的反应速度要明显快于耐药株。

图4 FaAST-MIC和BMD-MIC的比较热图。耐药菌用红色标记，敏感菌用蓝色标记。FaAST错误分类的组合用黑框突出显示。

图5 BALF样品中BMD-MIC和FaAST-MIC的比较。圆圈的大小表示具有相同mic值的测试的数量，颜色表示不同的抗生素。网格表示FaAST-MIC值错误。

原文链接： https://doi.org/10.1002/adhm.202101736