噬菌体辅助裂解和基于基因组DNA的食品致病菌污染检测

食源性疾病与人类生存密切相关，世界卫生组织报告，全球近6亿人因食用污染食物而生病，每年有42万人死亡。约三分之二的案例是由病原菌引起的。如果未经煮熟直接食用污染的蔬菜或新鲜食物，食物中毒风险较高。因此，准确识别引起食物污染的特定病原菌类型和污染来源至关重要。传统方法包括基于培养、免疫学和核酸的技术，但这些方法需要大量时间和劳动。另一方面，PCR具有优异的速度、敏感性和特异性，但无法区分活、死细菌。为了克服这些限制，噬菌体被提出作为一种可行的替代方案。噬菌体可以集成细菌溶解和DNA提取为一个步骤，简化了检测过程。此外，由于噬菌体只能在活性宿主内复制，它们可以帮助区分活、死细菌。

使用噬菌体辅助裂解和多重PCR检测食源性细菌的流程图

该研究提出了一种检测食物中细菌污染的新方法，该方法利用细菌噬菌体将目标细菌从污染的食物中回收并富集，然后通过多重PCR检测细菌DNA。此外，该研究还对三种新分离的噬菌体进行了表征，它们分别针对大肠杆菌（Escherichia coli）、李斯特菌（Listeria）和沙门氏菌（Salmonella），并展示了它们强大的抗菌活性和安全性。TEM分析和基因组分析证实了这些噬菌体的病毒特性和形态分类。

分析各种病原菌对噬菌体的敏感性

该研究调查了噬菌体针对特定细菌靶标的选择性。结果表明，三种噬菌体（LEC1、LBC9和LSE2）仅针对各自的目标细菌（大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌）形成透明裂解区，确认了它们的靶标特异性。此外，噬菌体对多种菌株具有裂解活性，表明它们能够检测物种内的多种菌株。噬菌体的靶标特异性不受其他细菌的存在影响，即使在多种细菌共存的环境中，它们也能选择性地裂解目标细菌。

该研究探讨了使用噬菌体选择性检测活细菌的方法。通过比较商业DNA提取试剂盒和噬菌体裂解提取DNA的方法，发现噬菌体对大肠杆菌和沙门氏菌的活细菌具有更高的DNA提取效率。然而，对于革兰氏阳性细菌（如李斯特菌），噬菌体提取DNA的方法对活细菌和死细菌的效率相似，这可能是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，导致噬菌体提取DNA的效率较低。

该研究还探讨了噬菌体裂解提取DNA的方法在不同孵育时间和细菌浓度下的效率。结果表明，随着孵育时间的延长，大肠杆菌的DNA提取效率提高，而李斯特菌则没有明显变化。沙门氏菌的DNA浓度随着孵育时间的延长而增加。此外，细菌浓度也会影响DNA的提取效率，细菌浓度越高，提取的DNA浓度越高。

使用噬菌体辅助DNA提取和多重PCR检测食品中的致病菌

该方法也应用于新鲜蔬菜的检测，结果表明，从受污染的蔬菜中回收细菌并使用噬菌体提取DNA可以有效检测目标细菌，并且没有观察到非特异性扩增产物。与其他使用噬菌体检测食物中细菌的研究相比，该方法具有独特的优势，包括更短的检测时间和更好的特异性。

本文作者开发了一种使用噬菌体辅助裂解和多重PCR检测食物中病原细菌的方法。三种噬菌体对各自的细菌宿主具有强大的抗菌活性，表明了它们在实际应用中的前景。该研究强调了噬菌体裂解的特异性，即使在复杂的细菌混合物中，也表明了这种方法在直接检测细菌DNA方面的有效性。虽然需要进一步研究噬菌体作用于革兰氏阳性菌的机制并优化DNA提取过程，但这项研究突出了这种方法的潜力。研究发现，1小时的孵育时间可以实现最有效的DNA提取和纯化，产生的PCR产物与商业试剂盒纯化DNA相似。食物应用实验证明了这种方法可以在3小时内从食物样品中检测到特定食物病原体，如大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和李斯特菌，浓度为10³ CFU/mL。多重PCR用纯化DNA确认了这些样品中存在靶标基因，验证了本方法的有效性。与通常依赖核酸检测的传统方法相比，这种创新方法为选择性和实际检测活的食物病原体提供了巨大的潜力，标志着食品安全领域的重大进步。

文献来源：https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2024.110433