一石三鸟型多功能材料提高荧光/比色双信号的生物测定效率

摘要：在这项工作中，我们报告了一种荧光和比色双读数生物测定法来检测DON，以确保公共食品安全。基于Zr-MOF (PCN-224;高孔隙率，大表面积，优秀的荧光猝灭性能)的特性，构建了多功能荧光比色信号探针，建立了DON的生物检测方法。铂纳米颗粒(Pt NPs)在外部原位生长，葡萄糖氧化酶(PPG)在内部储存。葡萄糖氧化酶和Pt NPs均被Zr-MOF富集，实现第一次信号放大，葡萄糖- TMB系统级联催化显色信号读出，实现第二次信号放大。PPG通过与荧光DNA自发形成的Zr-O-P键被淬灭，以获得高灵敏度的荧光读数。比色检测中自供H₂O₂进一步提高了双模分析策略的自准确性(来自两种不同信号转导机制的独立信号读出模式的准确性)。这种多功能PPG探针避免了不同探针的耗时组装，减少了复杂实验过程中不可控因素的误差积累。它可以灵敏和准确地检测DON，具有极好的检测限(荧光法为5.3 pg/mL，比色法为34 pg/mL)。总的来说，这项工作为构建基于多功能MOF探针的双信号生物传感平台提供了一种可行的方法。

图1. 基于多功能荧光和比色信号探针的双信号读出生物测定示意图。

图2. 多功能荧光和比色信号探针的表征。

采用透射电子显微镜(TEM)、x射线衍射仪(XRD)、能谱仪(EDS)、动态光散射仪(DLS)和zeta电位分析对多功能信号探针进行了表征。TEM图像(图2A)显示了PCN-224的纳米级亚球形形貌及其良好的分散性。PCN-224表面附着了大量微小的纳米颗粒(图2B)，元素测绘图像显示，N、O、C、Pt和Zr元素都沉积在PP中(图2C)，表明Pt NPs确实在表面原位生长。

通过不同条件下的TMB显色实验验证了PPG的催化能力。PPG、TMB和葡萄糖混合溶液的吸收峰明显，而TMB纯溶液和TMB与葡萄糖或PPG混合溶液的吸收峰几乎不明显（图3A）。此外，评价了PPG的比色定量能力。在葡萄糖-TMB系统中，TMB的吸光度随PPG浓度的增加而逐渐增加（图3B）。为了进一步验证PPG的定量能力，我们利用PPG构建了一个高灵敏度检测葡萄糖的传感器。随着葡萄糖浓度的增加(1 ~ 500 μM)，信号值逐渐增大(图3C)。在5 ~ 200 μM范围内，检出限(LOD)为1.24 μM（图3D）。这些结果证明所构建的PPG探针具有显著的催化和比色定量能力。

图3. 多功能信号探针(PPG)催化性能评价。

进一步地，评价了基于PPG的荧光定量可行性。首先，通过XPS测量谱显示PPGD含有Zr、Pt、S、P、O、N和C元素（图4A）。其次，对O 1 s核能级谱进行了曲线拟合分析。在533.1、531.9、531.5和530.2 eV处观察到4个峰(图4B)，其中Zr-O-P键的峰位于531.5 eV处。通过比较PPG与F-DNA相互作用前后的FTIR结果，发现在1039 cm⁻¹处有一个额外的峰，该峰应该来自F-DNA的磷酸主链。这些结果表明F-DNA可以通过形成配位键与PPG相互作用。第三，DNA在260nm处出现吸收峰。测定在PPG存在下FDNA作用前后的上清液中F-DNA的紫外吸收，以验证F-DNA与PCN-224相互作用。与PPG孵育后，上清液中F-DNA的吸收峰明显降低(图4C)，表明F-DNA确实可以与PPG相互作用并被吸附。第四，通过在F-DNA溶液中加入不同浓度的PPG来验证其荧光猝灭性能。随着PPG的加入，荧光强度不断降低(图4D)，进一步证明F-DNA通过与PPG的相互作用被猝灭，从而可以进行定量荧光分析。

图4. 基于PPG的荧光定量可行性评价。

随后对提出的双信号读出生物测定的分析性能进行了评估；在定量荧光分析策略中，竞争免疫反应获得的不同量的PPGA通过形成Zr-O-P键与F-DNA结合，猝灭TAMRA的强荧光，从而定量测定DON（图5A）。荧光信号(FL)随DON浓度在0 ~ 5000 ng/mL范围内逐渐降低(图5B)。在0.01 ~ 1000 ng/mL浓度范围内的线性范围如图5C所示，经拟合得到相应的线性关系（图5D），计算后，DON的检出限为0.0053 ng/mL。

在比色定量检测策略中，从竞争性免疫反应中获得的不同量的PPGA参与级联催化葡萄糖- TMB系统的显色发育，用于DON的定量分析(图6A)。吸光度随DON浓度从0到1000 ng/mL的增加而增加(图6B)。在0.1 ~ 500 ng/mL范围内，DON浓度与吸光度呈良好的线性关系(图6C)，其线性关系如图6D。在该策略下，DON的检出限为0.034 ng/mL。

图5. 定量荧光分析策略检测DON。

图6. 比色定量检测策略用于DON的分析。

总结：

Zr-MOF介导的荧光/比色双读出生物测定被开发和实施，DON作为概念验证。我们专门设计了Zr-MOF的所有特性，以实现高性能的双信号读出。利用Zr-MOF的大表面积和高孔隙率富集Pt NPs和GOx进行信号放大。它们的级联组合不仅进一步放大了比色信号读出，而且提高了检测精度。Zr-MOF的中心离子和配体可以高效猝灭荧光DNA，实现高灵敏度的荧光读数。双信号读出模式不仅具有互补优势，而且由于其内置校准，进一步提高了检测精度。独特的深空网络、双模读出、高灵敏度和精度的综合优势，展示了新型集成功能纳米材料在探测探针构建中的应用潜力。如何充分利用纳米材料的特性，高效构建多功能复合材料以满足更多的需求，无疑是当前的研究趋势，也是我们将继续探索的方向。

参考文献：

Hong F, Ren L, Chen Y. Kill three birds with one stone: Zr-MOF-mediated composite multi-functional materials to enhance the efficiency for fluorescent and colorimetric dual-signal readout bioassay[J]. Chemical Engineering Journal, 2023, 452: 139149.