具有样品预处理功能的纳米酶用于比色生物传感

摘要：纳米酶具有稳定性高、成本低、催化活性可调、修饰方便等优点，在生物传感领域得到了广泛的应用。然而，在纳米酶为基础的比色传感中同时实现高选择性和高灵敏度仍然是一个主要的挑战。纳米酶是具有酶模拟活性的纳米材料，通常用作样品预处理的固相吸附剂。我们的设计策略通过分离和富集将样品预处理功能整合到纳米酶中，从而提高了基于纳米酶的比色生物传感的选择性和灵敏度。作为概念验证，葡萄糖在本研究中被用作模型分析物。合理设计合成了苯硼酸修饰磁性纳米酶Cu/ Fe₃O₄@BA。通过硼离子亲和特异性吸附和消除磁分离后的干扰，提高了选择性。此外，采用磁固相萃取富集法提高了灵敏度。富集系数为50时，回收率可达80%以上。合成的磁性Cu/Fe₃O₄@BA至少可回收5次。该方法具有良好的选择性和灵敏度，操作简单，可循环利用等优点，为设计多功能生物传感纳米酶提供了一种新颖实用的方法。

如图1A所示，合成了苯硼酸修饰的磁性材料(Cu/Fe₃O₄@BA)。Cu/Fe₃O₄@BA可以在复杂样品中特异性结合葡萄糖，消除磁性固相萃取技术(MSPE)的干扰，可以用小体积的HAc-NaAc缓冲液(pH 5.0)洗脱。该工艺不仅消除了干扰，提高了选择性，还通过富集提高了灵敏度，用于后续的比色生物传感(图1b)。然后加入葡萄糖氧化酶(GOx)特异性催化葡萄糖产生H₂O₂，进一步增强了选择性。为了实现GOx和Cu/Fe₃O₄@BA纳米酶在同一缓冲体系中的优异催化活性，避免在检测过程中调整pH，我们在pH 5.0下合成了具有过氧化物酶样活性的Cu/Fe₃O₄@BA，这与GOx的最佳pH (pH 5.6)相似。

图1. (A) Cu/Fe₃O₄@BA的合成示意图和(B)葡萄糖检测的过程和机理示意图。

首先，采用溶剂热法合成了Cu/Fe₃O₄-NH₂纳米颗粒。其次，将Cu/ Fe₃O₄-NH₂与4-甲酰苯基硼酸混合，在80℃下搅拌，回流得到Cu/Fe₃O₄@BA(图2A)。此外，Cu/Fe₃O₄-NH₂的透射电子显微镜(TEM)图像(图2B)显示球形形貌。经苯硼酸修饰的Cu/Fe₃O₄@BA(图1C)的粒径与Cu/Fe₃O₄-NH₂相似，粒径分布在16 ~ 30 nm之间(图2B和C的插入图)，平均直径为25 nm。从能谱分析(EDS)可以看出，B、N、O、Fe和Cu元素均匀分布在Cu/Fe₃O₄@BA结构中(图2D和E)。

图2. Cu/Fe₃O₄@BA的制备及表征。

随后对Cu/Fe₃O₄@BA的过氧化物酶活性进行了评价。如图3A所示，在H₂O₂存在下，Cu/Fe₃O₄@BA在Ac - NaAc缓冲液(20 mM, pH 5.0)中对TMB具有催化活性，表明其过氧化物酶活性。此外，在Cu/Fe₃O₄@BA存在下，加入Na₂WO₄后的体系在650 nm处表现出更强的吸光度，说明Na₂WO₄对Cu/Fe₃O₄@BA具有显著的共催化作用。通过稳态动力学试验分析了Cu/Fe₃O₄@BA的过氧化物酶样活性。随着TMB浓度从0.03 mM增加到0.50 mM(图3B)， H₂O₂浓度从0.05 mM增加到0.6 mM(图3C)， Cu/Fe₃O₄@BA过氧化物酶的反应速率逐渐增加。得到了典型的Michaelis-Menten特征，表明底物催化符合模型的特征。如图3D所示，Cu/Fe₃O₄@BA + Na₂WO₄ + H₂O₂和Cu/Fe₃O₄@BA + H₂O₂均有明显的特征⋅OH峰，且Cu/Fe₃O₄@BA + Na₂WO₄ + H₂O₂的峰强度更强。这意味着Cu/Fe₃O₄@BA + Na₂WO₄ + H₂O₂产生更多的⋅OH。图3E证实了⋅O₂⁻的存在，也表明Cu/Fe₃O₄@BA + Na₂WO₄ + H₂O₂产生更多的⋅O₂⁻。结果表明，Cu/Fe₃O₄@BA + Na₂WO₄ + H₂O₂具有较强的过氧化物酶样活性。实验表明Na₂WO₄只影响Cu²⁺的价态，加速了Cu²⁺/Cu⁺的循环，而对Fe³⁺的价态几乎没有影响。图3F 描述了Na₂WO₄增强了Cu/Fe₃O₄@BA过氧化物酶样活性的机理。

图3. Cu/Fe₃O₄@BA的过氧化物酶活性。

最后，构建了基于Cu/Fe₃O₄@BA比色传感器的葡萄糖检测平台。如图4A所示，用Cu/Fe₃O₄@BA富集MSPE从大体积样品中提取葡萄糖。然后，在洗脱液中加入GOx、Na₂WO₄和TMB。GOx催化葡萄糖生成H₂O₂, Cu/Fe₃O₄@B催化H₂O₂生成ROS，将TMB转化为蓝色oxTMB进行比色分析。由于洗脱液pH为5.0，弱酸性条件下避免了pH调节的中间步骤，使实验过程更加方便。在优化的实验条件下，构建的比色传感平台能够检测oxTMB的颜色变化，用于葡萄糖的定量检测。如图4B所示，随着葡萄糖浓度的增加(0.5 ~ 30 μM)，反应体系的A650增强，溶液颜色逐渐变蓝，说明可通过紫外可见分光光度计进行葡萄糖检测。如图4C所示，在0.5 ~ 30 μM的葡萄糖浓度范围内，响应呈线性关系，检测限(LOD)为0.183 μM。进一步考察上述方法检测葡萄糖的选择性和特异性。如图4D所示，只有葡萄糖(10 μM)对A650有明显的增强作用，而当每种干扰物质的浓度提高10倍时，对A650的颜色变化不大。虽然Cu²⁺ (100 μM)也增加了吸光度强度，但尿液和血清中Cu²⁺的含量很少。结果表明，所建立的纳米酶与MSPE比色传感相结合，对葡萄糖的测定具有良好的选择性。

图4. 基于Cu/Fe₃O₄@BA比色传感器的葡萄糖检测。

总结：成功制备了一种基于过氧化物酶样Cu/Fe₃O₄@BA的特异性富集和催化分析策略，实现了对复杂样品基质中葡萄糖的可靠、方便和敏感的检测。改性苯硼酸能以硼酸亲和力特异性结合复合样品中葡萄糖的顺二醇结构，并能通过MSPE去除样品中的干扰。然后，在pH 5.0下洗脱葡萄糖，实现葡萄糖靶分子的特异性富集，提高了比色检测灵敏度，LOD低至0.183 μM。然而，该策略的富集因子不高，限制了灵敏度的提高。因此，需要进一步的研究来提高这种敏感性。在未来，该策略可用于检测脑脊液、眼泪、唾液和汗液等样品中的低浓度葡萄糖，而不会受到其他物质的干扰。该方法在生物医学和生物技术领域具有广阔的应用前景。

参考文献：

Wu J, Liang L, Li S, et al. Rational design of nanozyme with integrated sample pretreatment for colorimetric biosensing[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2024: 116310.