一种无需 DNA 提取和扩增即可超灵敏检测活沙门氏菌的检测工具

根据世界卫生组织（World Health Organization， WHO）的数据，食源性疾病每年影响全球约十分之一的人口，导致超过420,000人死亡，其中致病菌是主要原因。因此，食源性病原体对人类健康构成严重威胁。但是只有活的致病菌才能污染食物来源或环境。因此，检测样品中的活细菌对于避免非活细菌的污染具有重要意义。平板计数法是检测细菌的金标准，尽管它很耗时，通常持续2-4天，并且不能检测到一类存活但不可培养状态的细菌。此外，传统的聚合酶链反应（PCR）和定量实时聚合酶链反应（qPCR）DNA检测方法需要核酸提取和扩增，过程中容易受到污染并且无法区分DNA与活细菌和非活细菌，可能导致假阳性结果。RNA在细菌死亡后迅速降解，因此可用作活细菌的标志物，可通过RNA的RT-PCR检测进行定量。然而，RNA的半衰期很短，而且不稳定。单叠氮化乙锭 （EMA） 或单叠氮丙啶 （PMA） 可以区分活细菌和非活细菌，通过穿透非活细菌的细胞壁并与它们的 DNA 交联，抑制其扩增，而活细菌的 DNA 扩增不受影响来实现。然而该方法仍然需要核酸结合染料的帮助，并且需要扩增。三磷酸腺苷 （ATP） 是一种能量来源，在活细胞中维持在相对恒定的水平，因此可以反映活细菌的数量。ATP生物发光（ATP-BL）通常用于检测活细胞，但它存在于多种细胞中，缺乏识别细菌种类的能力。因此，继续开发检测活细菌的新方法非常重要。

噬菌体是一种广泛存在于环境中的病毒，由于其安全性、特异性和低成本，被用于检测食源性病。噬菌体可以特异性识别活的宿主细菌，高特异性有助于分离食物基质中的靶病原体，从而显著减少假阳性结果的发生。Argonaute （Ago） 蛋白是广泛使用的核酸引导酶，通过互补碱基配对识别靶 DNA。Pyrococcus furiosus Argonaute （PfAgo） 是一种典型的核酸内切酶，由耐热古细菌 Pyrococcus furiosus 产生，并由向导 DNA （gDNA） 引导。与CRISPR系统相比，PfAgo选择靶DNA的切割位点不需要原间隔相邻基序（PAM）介导的特定序列。适配体是通过指数富集 （SELEX） 产生的单链寡核苷酸配体，与特定靶标紧密结合，其中二价适配体可有效提高与靶标结合的能力；本文作者的目标是将二价适配体和 PfAgo 结合起来，构建一种灵敏的 DNA 提取和扩增无检测方法，用于检测活沙门氏菌。

图 1.用于检测活沙门氏菌的PDAAF生物传感器示意图。（A） 活沙门氏菌的噬菌体侵染和裂解过程。（B） MNP-BAPT综合体的建设和对ATP的承认。（C） PfAgo的两步裂解能力。（D） 通过PDAAF生物传感器检测活沙门氏菌。

在这项工作中，噬菌体可以特异性识别并裂解活沙门氏菌以释放DNA和ATP（图1A）。首先，作者设计了一种ATP二价适配体，该适配体由5'端修饰磷酸基团的gDNA和2个生物素-ATP适配体组成，通过生物素-链霉亲和素系统将其偶联到磁性颗粒上构建了MNP-BAPT（图1B）。然后，作者又设计了3个gDNA来结合PfAgo以识别沙门氏菌DNA，并将短链DNA精确切割为二级gDNA，再次结合空载的PfAgo切割荧光探针，以实现PfAgo的两步切割能力（图1 C）。当沙门氏菌存在于样品中时，上述构建的MNP-噬菌体能够识别并捕获它，并使用磁分离将其与样品分离。噬菌体只能裂解活的沙门氏菌，释放DNA和ATP。当 ATP 存在时，MNP-BAPT 优先结合 ATP 并释放 gDNA。磁性分离后，上清液中的gDNA与PfAgo组装，识别并切割FQ荧光探针链，从而产生荧光信号。接下来，通过添加三条专为沙门氏菌DNA设计的gDNA链，他们能够结合PfAgo以识别沙门氏菌DNA，并实现FQ荧光探针的两步裂解以产生荧光信号。我们同时收集了两种途径产生的荧光信号，实现了信号增强（图1D）。DNA和ATP协同触发荧光探针在单个试管中裂解两次，有效增强了PDAAF生物传感器的灵敏度，无需DNA提取或扩增即可检测活菌。本工作为通过简单地替换识别元件来检测各种活食源性病原体提供了广阔的应用前景。

图 2.PfAgo 的 DNA 或 ATP 触发的切割能力的可行性验证和主要表征。（A） PfAgo两步裂解能力示意图。（B） PfAgo裂解ssDNA的电泳图3（gDNA4添加到泳道 1;ssDNA的3，车道2;gDNA （英语：gDNA）4和 ssDNA3，车道3;PF公司Ago 和 ssDNA3，车道4;和 PfAgo，ssDNA3和 gDNA4，车道 5）。（C）提取的沙门氏菌DNA浓度与荧光信号强度的关系。（D）二价适配体捕获ATP和碱基的示意图。（E）二价适配体的杂交电泳（ATP适配体加入泳道1;gDNA，泳道2;适配体和gDNA杂交复合物，泳道3）。（F） MNP和MNP-BAPT的Zeta电位。（G） MNP和MNP-BAPT的粒径。（H） ATP标准品浓度与荧光强度的关系。

在噬菌体对活沙门氏菌和非活沙门氏菌的裂解能力的验证实验中发现，噬菌体只能裂解活沙门氏菌，在双层板上产生噬菌体斑点。与此同时 PfAgo 展现出了良好的切割活性（图2 B和C）。图2E验证 ATP 触发的 PfAgo 裂解活性（图2 F和G），表明MNP-BAPT成功构建。图2H揭示了ATP浓度和荧光信号之间的强烈趋势：荧光强度随着ATP浓度的增加而增加。这表明构建的MNP-BAPT复合物可以特异性识别ATP并引导FQ荧光探针的PfAgo定向裂解。考虑到这一点，作者构建了PDAAF生物传感器，以使用无DNA提取和扩增的过程协同检测活沙门氏菌的DNA和ATP。

在此基础上，作者又构建了噬菌体辅助DNA触发的Argonaute介导荧光（PDAF）、噬菌体辅助ATP触发的Argonaute介导的荧光（PAAF）和PDAAF生物传感器。验证了三种生物传感器检测活沙门氏菌的能力，并表明可以协同检测 DNA 和 ATP 的 PDAAF 生物传感器与其他两种仅由 DNA 或 ATP 触发的荧光信号相比，有效地增强了荧光信号（图 3 B）。

图 3.PDAF、PAAF 和 PDAAF 生物传感器检测活沙门氏菌的有效性：（A） 基本原理，（B） 结果，（C） 标准曲线和 （D） 生物传感器检测活沙门氏菌的线性范围。

为了实现PDAAF生物传感器的最佳检测性能，对选定的关键参数进行了优化。MNP-BAPT的最佳浓度为500μg/mL、PfAgo最佳反应浓度为500 μg/mL、gDNA最佳浓度为5μM、最优反应时间为30 min、 MNP-噬菌体对沙门氏菌的最佳捕获时间为15分钟、FQ荧光探针的最佳浓度为5 μM。作者使用PAAF生物传感器检测沙门氏菌裂解产生的ATP，表明检测范围为10³-10⁷CFU/mL（图 3C 和 D）。实验还同时检测了沙门氏菌裂解产生的DNA和ATP。在最佳条件下，检测的线性范围可以达到10²-10⁷CFU/mL。而qPCR可以检测出浓度范围内为10²-10⁷CFU/mL，qPCR产生的结果与PDAAF生物传感器相似，表明其在灵敏度和线性范围方面与后者一致。

使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌作为干扰菌来评估 PDAAF 生物传感器检测沙门氏菌的特异性。如图4A所示，沙门氏菌产生的荧光强度变化明显大于其余干扰细菌，表明PDAAF生物传感器对沙门氏菌具有良好的特异性。此外，添加不同沙门氏菌混合物的荧光强度变化没有显着差异，表明生物传感器对沙门氏菌具有出色的检测能力（图 4 B）。

图 4.PDAAF生物传感器检测活沙门氏菌的特异性。（A） 用PDAAF生物传感器检测到的食源性病原体，包括沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌。（B） 使用PDAAF生物传感器检测到的沙门氏菌和其他食源性病原体的混合物;沙门氏菌的浓度为 106CFU/mL 和其他致病菌在 108CFU/mL，不含任何致病菌的生理盐水作为阴性对照。

在此，作者测试了PDAAF生物传感器在加标和真实样品中检测沙门氏菌的可行性。按照国家标准从武汉教育超市采购并预处理鸡肉样品，并在样品中添加不同浓度的沙门氏菌，不含细菌。在最佳条件下，回收率在87.72%-113.97%之间，变异系数在3.72%-6.88%之间，表明PDAAF生物传感器能够高灵敏度检测样品中的沙门氏菌。为进一步验证PDAAF生物传感器在真实样品中的性能，采用PDAAF生物传感器、标准qPCR法和孔板计数法对武汉生鲜市场采集的真实样品中的沙门氏菌进行检测。这些检测结果表明，猪肉样本 4 和 8、鸡肉样本 5 和 7、牛肉样本 4 和鸡蛋样本 15 均呈沙门氏菌阳性（图 5）。PDAAF生物传感器对真实样品的检测结果与孔板计数和qPCR方法一致，表明PDAAF生物传感器对复杂食品样品中活沙门氏菌的检测具有较高的准确性。然而，孔板计数方法涉及相对较长的周期时间，约为 2 天，并且 qPCR 需要复杂的 DNA 提取和扩增过程，这也相对较长。另一方面，PDAAF生物传感器消除了对复杂预处理步骤的需求，并允许无DNA提取和扩增过程，这不仅实现了快速检测（2 h），而且还避免了气溶胶污染。

图 5.用于检测活沙门氏菌的 PDAAF 生物传感器的真实样品分析。使用 PDAAF 生物传感器、平板计数法和标准 qPCR 检测猪肉、鸡肉、牛肉和鸡蛋样品中沙门氏菌的比较热图。

本文介绍了一种噬菌体辅助 DNA 和 ATP 协同触发的 PfAgo 介导的生物传感器，用于检测食品样品中的活沙门氏菌。结合噬菌体特异性感染和裂解沙门氏菌释放DNA和ATP的能力，以及PfAgo的两步靶点切割能力，该生物传感器无需DNA提取和扩增即可实现活沙门氏菌的特异性检测，实现10的线性检测范围2CFU/mL 至 107CFU/mL，LOD 为 20 CFU/mL。结果表明，开发的PDAAF生物传感平台为检测活的食源性病原体提供了一种超灵敏和直接的工具；然而，目前很难进行多路检测，在未来工作中可以针对这个缺陷进行优化。

参考文献：Xufeng Wang, Xiaobo Hu, Shixing Pan, Yu Zhang, Junpeng Zhao, Feng Jiang, Yingjun Li, Yiping Chen, DNA and ATP synergistically triggered Argonaute-mediated sensor for the ultrasensitive detection of viable Salmonella without DNA extraction and amplification, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 408, 2024, 135543, ISSN 0925-4005, https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135543.