基于等离子胶体的多功能平台用于细菌鉴定和抗菌素耐药性检测

抗菌素耐药性（AMR）严重危害人类公众健康，且给人类社会带来了巨大的经济负担。AMR的成因复杂，许多社会层面的人类行为，如在农业、畜牧业抗生素的滥用，临床的经验性用药都会加剧AMR。因而，快速、准确的病原鉴定及其药敏测试（AST）和精准的个性化治疗对于限制耐药的传播至关重要。目前，质谱技术（例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱，简称MALDI-TOF MS）已成为临床实验室识别病原体的主要手段。该技术通过分析来自细菌细胞表面、细胞膜和核糖体的蛋白质信息，创建细菌的蛋白质指纹图谱。实验时，研究人员将待测样本的蛋白质指纹图谱与数据库中已知的指纹图谱进行比对，即可获知病原的种类。然而，基于质谱的病原鉴定常常是基于纯化培养物的，细菌的纯化增殖过程至少需要48 h。提高质谱分析灵敏度是缩短培养时间最好的解决方案，而这可以通过缩小待分析样本的体积实现。常规质谱分析中，MALDI靶板上通常每个分析模块（2.5 mm）上会涂抹上10⁴到10⁵个细菌（0.1 mm），从大小上来看，无疑是有很大一部分细菌是多余的/被浪费的。基于此，本研究了提出了等离子胶体的应用，通过将细菌包裹在刚性微米级大小的胶体内，缩短检测周期的同时以尽量减少资源浪费。另外，考虑到质谱分析在当前临床实验室的主要应用局限（菌种鉴定），以及临床实验室困境：AST结果落后病原鉴定结果至少24 h，作者将等离子胶体概念应用于另一平台：拉曼技术，以在菌株水平完成病原鉴定和药敏分析。

作者制备了2种等离子胶体：PFDT-Au NPs和PFDT-Ag NPs并对细菌进行包封（图1 a-b）。PFDT-Au NPs（图1 d）因其干扰性较低而用于质谱鉴定，PFDT-Ag NPs则因其拉曼信号增强性能较好而用于拉曼散射实验。PFDT-Au NPs的尺寸直径约为30 nm，放在MALDI靶板上会沉积成一个圆形的干燥样品点（图1 c），且在细菌封装后仍能保持准圆形。另外，制备的胶体具有良好的生物兼容性，不会干扰细菌的正常增殖分裂（图1 e-f）。对胶体性能进行表征后，作者将封装了细菌的胶体（100-200 μm）放置在MADLI靶板上进行分析（图2 a-b），胶体的直径与LRF-MALDI-TOF的激光束尺寸相似。也就是说，激光照射在胶体上时，即可以直接分析胶体中的所有细菌细胞，这使得接近100%的分析样品得到了有效利用，且避免了常规分析中可能发生的噪声积累。作者采用了4种病原菌：铜绿（PA），金葡（SA），肺克（KP），大肠（EC）作为例证，如图2 c-f所示，当胶体内细菌数量低至50时，MALDI TOF仍可准确完成细菌鉴定。相较于常规质谱，细菌数量减少至10⁴会导致出峰结果减少，本方案的结果与10⁶个细菌数目的出峰结果一致。因而，可以说，本方法灵敏度提高了100倍。

进一步，作者研究了等离子胶体在拉曼光谱中的应用，并实现了菌株水平的细菌分型。在这里，作者首先利用胶体封装了4种病原菌：铜绿CICC 21636、金葡ATCC 25923、大肠ATCC 25922和肺克CICC 21519，从中随机选择5个胶体用于特征光谱收集，并利用第二强拉曼峰与最强拉曼峰的强度比评价了方法的重复性。结果显示，方法具有良好的重复性，4种病原的标准偏差为：大肠（I1334/I1658）:9.0%，肺克（I1334/I1658）:7.3%，金葡（I1334/I1658）:5.3%，铜绿（I1585/ I746）:9.8%。然后，作者利用6株铜绿标准株，探索了方法在菌株水平上进行菌株分型的可行性（图3 a-b）。随后，作者利用该方法分析了6株不同的大肠杆菌，包括3株β-内酰胺酶阳性（ESBL+）和3株β-内酰胺酶阴性（ESBL−），以评估方法在检测细菌耐药性上的应用价值。如图3 c-d所示，基于等离子胶体的拉曼光谱能够准确区分出敏感和耐药株。

总的来说，作者描述了一个基于等离子胶体的平台，既能够实现高灵敏的病原鉴定又能够在单细胞水平实现AMR检测。所提出的等离子胶体，具有很好的生物兼容性：封装在胶体内的细菌可以培养24 h及以上，而这也使得研究细菌耐药性和分析细菌代谢物成为可能。本研究探索了等离子胶体在质谱和拉曼技术中的应用，一方面克服了质谱鉴定的“样品浪费”的局限性，一方面又验证了胶体在拉曼光谱中的应用可行性以及拉曼光谱进行耐药检测的可行性。尽管微小体系内的分析，已得到了广泛的研究，例如热点研究：液滴微流控，但是本文提出的等离子胶体能够提供一个刚性的活动空间，稳定性更好。不过，值得指出的是，本研究仍处于概念验证阶段，验证菌株数量极少，尤其是在耐药菌的检测内容上，比较单薄。方法的进一步应用，尚需进一步深入研究。

图1 （a）等离子胶体的制备、细菌的封装及培养流程；（b）乳化过程；（c）一个干燥的PFDT-Au NPs的FESEM图像（比例尺：20 μM）；（d）封装了一个细菌的PFDT-Au NPs的FESEM图像（比例尺：100 μM）；（e）（d）图中细菌的放大显微镜成像（比例尺：25 μM）；（f）（d）在培养24 h后，（e）中细菌分裂出来的5个细菌的显微镜成像（比例尺：25 μM）。

图2 （a）MALDI靶板上干燥的等离子体胶体的图像。（b）干燥的胶体的大小分布。（c-f）等离子胶体中依次封装51±11、58±13、57±6、84±10个PA、SA、EC和KP后的质谱鉴定结果。与细菌细胞成分对应的峰用星号表示。

图3 （a）6株铜绿假单胞菌标准株拉曼光谱。（b）6株铜绿假单胞菌（CICC 20152、CICC 20236、CICC 21625、CICC 21636、CICC 21641、CICC 21643）的拉曼光谱聚类结果。（c）ESBL^-大肠杆菌（CICC 10668、CICC10661、ATCC25922）和ESBL⁺大肠杆菌（17032511、CICC 10663和17032404）的拉曼光谱图。（d）ESBL-大肠杆菌和ESBL+大肠杆菌的PLS-DA结果。每个菌株进行5个技术重复。

原文DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04038