GoPhAST-R：快速检测病原抗生素敏感性的药敏测试新方法

多重耐药菌严重危害人类健康。临床上多重耐药菌感染引起的死亡率和广谱抗生素使用频率因病原鉴定方法的延滞性而不断上升，因而临床上迫切需要发展一种快速、准确的抗生素敏感性测试（Antibiotic susceptibility testing，AST）方法以解决加速增长的抗生素耐药性问题。目前，基于细菌生长的AST方法，如微量肉汤稀释（Microbroth dilution，MBD），尽管能直接回答抗生素是否能够抑制病原菌生长的关键问题，但需要数日时间来获得实验结果由此造成病情延误。基于病原生长的AST，在根本上受到病原繁殖速度限制。然而，新的基于基因型的AST尽管能够避免细菌的分离培养，但却面临着细菌耐药性机制持续增长的多样性和复杂性的挑战。另外，在多重耐药微生物（Multidrug resistant organisms，MDROs）中，碳青霉烯耐药革兰氏阴性菌（Carbapenem-resistant organisms，CRO）因其所剩抗生素治疗方案很少（或没有）最让人担忧。然而，CRO的表型鉴定具有一定挑战性，这是由于一些耐药菌株会被当前的表型鉴定错误地确定为敏感菌；尽管多重PCR可以检测常见的几种碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE），但仍然约有13%-68%的CRE会被遗漏，对于非CRE的CRO，因其耐药机制持续发展且研究不够，更难通过这种方法实现准确检测。这样的检测环境使得临床微生物实验室仍在寻求共识：如何应用多种方法，包括表型、基因和生化检测，更好地检测CRO。基于此研究背景，Deborah T. Hung研究组发展了一种基因型和表型AST联合快速检测方法GoPhAST-R（Combined genotypic and phenotypic AST through RNA detection），其检测原理是：在短暂的抗生素暴露处理后，敏感和耐药菌中特定的mRNA表达水平存在差异，通过研究这种差异，即可快速完成病原药敏鉴定。在这里，mRNA序列既因具有基因编码区能够呈现细菌遗传信息，又因其丰度与蛋白表达水平的正相关关系展示耐药表型信息。 在实验内容上，作者首先利用RNA-Seq监测敏感（S）/耐药（R）各2株的肺炎克雷伯（Klebsiella pneumoniae, K.pn）、大肠杆菌（Escherichia coli, E.co）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii, A.ba）临床分离株在CLSI断点浓度下的美罗培南（60 min），环丙沙星（30 min）和庆大霉素（60 min）处理下的转录水平变化。图1.a展示了K.pn的转录水平变化，证明了方法的可行性。为了高分辨率地区分病原的S/R，作者分别筛选出了这三种病原及其抗生素组合的S/R的响应强烈且稳定的前十转录本（如图1.b示例K.pn，其余详见SI，下同），并开发了相应的机器学习算法对这些转录信息进行分析继而实现菌株S/R的二元分类。对于所开发的算法，作者也基于所有11种细菌-抗生素组合，选用109株分离株作为训练队列，108株分离株作为验证队列。结果显示，与MBD结果相比，在108株菌株中算法正确分类了100株，其中52株耐药株中51株完成了正确分类，38株敏感株中35株完成了正确分类（图1.c）。随后，作者引入了碳青霉烯类耐药决定因子转录本的分析，这些基因型信息可以补充GoPhAST-R基于表型的AST分类，同时提供有价值的流行病学数据。结果显示，GoPhAST-R可以正确检出38株菌株中已被WGS证明存在的39个碳青霉烯酶基因（图2），由此证明在一次实验中，GoPhAST-R可以提供耐药表型和基因型信息，从而实现最准确的AST分类并给出额外的有价值的耐药信息。然后，作者利用GoPhAST-R快速测定了阳性血液培养物中的K.pn和E.co对环丙沙星的敏感性。图3显示，GoPhAST-R从6个E.co阳性血培养瓶中实现了3株敏感和3株耐药菌的区分；另外2个K.pn阳性血液培养瓶的菌株敏感性也得以准确鉴定，由此证明了方法的临床应用价值。为了缩短结果报告时间，作者将GoPhAST-R与NanoString Hyb＆Seq检测平台结合，使得可以在阳性血液培养物中实现快速AST（图4.a）。Hyb&Seq的检测策略和原理见图4.b-c。最后，作者利用此方案在4 h内完成了6株临床K.pn分离株的美罗培南药敏测试，并获得了相关碳青霉烯酶基因信息（图4.d）。

总的来说，作者创新性地发展了一种基于RNA检测的基因型和表型双定位的抗生素敏感性测试方法，这种方法可以扩展至任何感兴趣的病原-抗生素组研究上，仅需抗生素在敏感株和耐药株中引起不同的转录反应。此策略既能实现病原AST又能提高AST准确性，避免了耐药机制问题，具有“双管齐下，事半功倍”的显著优势。

图1 抗生素暴露时的差异基因表达实现菌株S/R鉴定。a. 利用CLSI断点浓度下的美罗培南（60 min），环丙沙星（30 min）和庆大霉素（60 min）分别处理各2株S/R K.pn后获得的RNA-seq信息（MA图）；b. CLSI断点浓度下的美罗培南，环丙沙星和庆大霉素分别处理24、18、26株K.pn临床分离株后获得的前十位抗生素-转录本响应信息；c. 基于抗生素暴露处理K.pn后所得的NanoString数据的GoPhAST-R耐药性预测结果与BMD定量结果一致性分析。横轴表示通过BMD获得的MIC值，纵轴表示GoPhAST-R对菌株的耐药性预测分值。每个象限的数字表示GoPhAST-R结果和BMD结果的一致/不一致的数量。

图2 GoPhAST-R检测碳青霉烯酶基因和ESBL基因含量。a-c，WGS在42株K.pn，20株E.co，13株A.ba分离株中检测到的碳青霉烯类酶和选择的ESBL转录本信息（左侧）与GoPhAST-R、BMD（右侧）预测菌株对美罗培南S/R结果的一致性分析。垂直虚线区分碳青霉烯酶基因和ESBL基因。

图3 GoPhAST-R方法应用于阳性血液培养瓶中病原的检测。从8个阳性血液培养瓶（6个培养E.co：A-F，2个培养K.pn：G-H）获得的环丙沙星-代表性转录本信息的归一化、对数转化倍增热图。

图4 GoPhAST-R结合NanoString Hyb＆Seq平台在4 h内实现菌株表型药敏检测及相关耐药基因的检测。a. 基于NanoString Hyb＆Seq平台的GoPhAST-R检测阳性血液培养瓶中病原的工作流程。b. Hyb＆Seq杂交方案：靶向每种RNA转录本信息的探针组被杂交在粗裂解液中。探针A包含编码序列（绿色）和3’端共有的一段捕获序列；探针B包含用于表面固定的生物素基团（灰色）和5’端共有的一段捕获序列。c. Hyb＆Seq检测原理：固定，纯化的三元探针-目标复合物进行连续循环的多步成像，以实现具有空间分辨率的单分子检测。每个循环包括报告探针结合和检测，紫外裂解，第二轮报告探针结合和检测，以及低盐洗涤来未结合的探针-目标复合物。5个Hyb＆Seq循环获得的数据用于分析。d. 6株临床K.pn分离株的快速美罗培南药敏测试。顶部：Hyb&Seq检测到的前10个美罗培南响应转录本的归一化、对数转化倍增的热图。底部：Hyb＆Seq分析系统测量所得的碳青霉烯类和选择的ESBL转录本数据在减掉背景后的归一化对数转化倍增热图。

文章doi：10.1038/s41591-019-0650-9