基于AuNPs/明胶/AuNCs纳米复合材料的基质金属蛋白酶-9作为肿瘤生物标志物的双模式荧光比色检测

  摘要：基质金属蛋白酶(MMPs)是一种重要的蛋白水解酶，其高表达与肿瘤的恶性进展有关。本研究基于明胶酶活力建立了一种新的灵敏的检测MMP-9的方法。以明胶为衬底制备了绿色发射金纳米团簇(AuNCs)，然后将明胶/AuNCs包覆在金纳米颗粒(AuNPs)表面，制备了AuNPs/明胶/AuNCs纳米复合结构。所合成的纳米复合材料的表征和形貌表明，成功地形成了AuNPs@明胶/AuNCs。所构建的纳米复合材料由于AuNCs/AuNPs结构的接近，表现出内部FRET的发生和AuNCs的荧光猝灭。在生理盐水缓冲液中，MMPs酶对AuNPs/明胶/AuNCs的水解作用导致了金纳米粒子表面等离子体共振(SPR)的变化，同时由于抑制了内部FRET过程而增强了AuNCs的荧光发射。该平台可实现肉眼对MMP-9的半定量检测，且比色法和荧光法的检出限分别为2 ng/mL和0.25 ng/mL。此外，该方法用于检测人血清基质中的MMP-9具有适当的回收率。我们的工作为简单鉴定和精确检测MMP-9提供了一种高效、方便、实用的工具。

  基于AuNPs@明胶/AuNCs纳米复合平台的基质金属蛋白酶-9双模检测机制

  利用一种新型的纳米复合材料制备了基于AuNPs和AuNCs的比色和荧光检测平台，用于双模式检测MMP-9酶(方案1)。在比色模式下，MMP-9的酶活性导致AuNPs的聚集引起颜色变化;在荧光模式下，利用AuNPs诱导FRET机制来检测MMPs的活性。首先，以明胶为底物合成AuNCs作为荧光探针。然后将制备的明胶/AuNCs沉积在AuNPs表面，构建生物传感平台。AuNPs周围的明胶层抑制了AuNPs的聚集，导致了以AuNPs为核心和以明胶负载的AuNCs为壳层之间的FRET发生。这种新的机制是基于明胶酶的活性而设计的，可以通过去除AuNPs周围的明胶层，恢复猝灭的荧光。此外，在生理盐水缓冲溶液中，裸露的AuNPs的存在导致了NPs的聚集和紫色的变化，这是检测MMPs酶活性的另一个指标。

  AuNPs@明胶/AuNCs的表征

  将所制备的明胶/AuNCs作为包覆层沉积在球形AuNPs周围，作为检测平台。用透射电子显微镜分析了合成的AuNPs@明胶/AuNCs的大小和形貌。如图1A所示，观察到平均尺寸为18 nm的球形AuNPs，并在透射电子显微镜图像中证实了AuNPs周围明胶/AuNCs层的存在。根据获得的透射电子显微镜图像，还确定了AuNPs的尺寸分布，显示出纳米颗粒的正态分布，大多数合成的AuNPs的直径为16-20 nm(图1B)。紫外可见光谱还表明，由于合成的Au纳米颗粒具有表面等离子体共振性质，裸露的Au纳米颗粒的最大吸收波长(λmax)在522 nm处，而明胶/Au纳米颗粒表面沉积后观察到3 nm的蓝移，λ最大吸收波长为525 nm(图1C)。AuNPs@明胶/AuNCs的吸收峰强度较低，说明明胶层的作用使SPR性能降低。如图1D所示，FTIR分析表明，AuNPs的红外吸收光谱位于3417 cm^-1、1588 cm^-1、1367 cm^-1、1077 cm^-1和628 cm^-1的吸收峰对应于氧官能团(光谱b)。这些峰的强度在明胶功能化后减弱或消失，位于2920 cm^-1、1639 cm^-1、1444 cm^-1和619 cm^-1的明胶特征峰表明明胶/AuNCs层成功地沉积在AuNPs周围(光谱a)。

  应用检测平台的验证

  Zeta电位是提供有关纳米颗粒表面电荷信息的关键参数。结合对MMP-9酶的光学生物传感，本研究测定了AuNPs的固有Zeta电位，以证实明胶/AuNCs的成功沉积以及随后的变化。如图2a所示，裸露的AuNPs的Zeta电位约为-32 mV。在AuNPs周围沉积明胶/AuNCs层后使Zeta电位值增加到-14 mV。研究表明，高盐浓度为蛋白质在柠檬酸还原的AuNPs表面沉积提供了最佳条件，并导致Zeta电位值增加。构建的平台与MMP9酶孵育后得到的AuNPs的Zeta电位约为零(+0.5 mV)，证实了AuNPs的不稳定和团聚。加入MMP9酶后，AuNCs的荧光强度和对AuNPs的吸收也发生了变化。图2b显示了MMP-9对AuNPs@明胶/AuNCs作用后AuNCs的荧光发射显著增强，并且在紫外光照射下可检测到荧光增强。MMP-9的加入也将分散的AuNPs的吸收光谱改变为聚集态，可见颜色从红色变为紫色(图2c)。实验结果证实了所设计的检测MMP-9酶平台的性能。

  检测方法的优化

  为了确定最佳的检测条件，在相同浓度的纳米复合平台和MMP-9酶作用下，测定了反应体系的pH值、温度和孵育时间等基本参数。以前的研究已经表明，MMP-9的活性依赖于环境条件，如孵育时间、温度和pH。测定的最佳pH范围为4-12，如图3a所示，所制备的纳米复合材料的荧光回收率在酸性条件下表现出强烈而稳定的荧光，并在pH为8时达到最大荧光发射。随着pH升高到pH 11，荧光减弱，并在碱性条件下保持稳定。还对比色检测的优化进行了研究，结果表明，在pH值为7时，检测方法的性能最好(图3b)。因此，根据实验结果，考虑到血液基质的pH值范围为7-7.5，确定了最适pH值为7，在接近自然的血样条件下进行实验。探讨了生物传感器在不同温度范围内的有效性。如图3c和图d所示，在不同温度下热孵育后没有观察到明显的变化。结果表明，紫外可见光谱和荧光光谱受温度波动的影响较小，具有较好的热稳定性。因此，以37 ℃的体温作为测定温度。随后在8 h-72 h范围内测定了孵育时间参数。如图3e所示，加入MMP-9前后的最大荧光发射量分别为F0和F。随着时间的延长，荧光发射光谱逐渐增强，60 min达到最大值，并在6 h内保持恒定和稳定。此外，还探讨了UV-Vis比值，其中A0和A代表与MMP-9酶孵育前后的吸光度。光谱显示出类似于荧光测定法的趋势，并在大约90 min达到平台期(图3f)。获得的最佳孵育时间低于需要 >5 小时的传统 ELISA 方法，并且与已报道的检测MMP酶的新策略相当。根据这些结果，为了给两种方法提供最佳条件，选择90 min作为后续检测的最佳孵育时间。

  检测MMP-9酶的比色响应

  随着反应样品中MMP-9酶的加入，所应用的AuNPs的吸收SPR光谱在525 nm处发生了减色位移，在660 nm处发生了增色位移，溶液的颜色从红色变为紫色(图4)。观察到的结果是由于MMP-9酶的明胶酶活性消化了AuNPs的明胶涂层，从而产生了AuNPs的聚集状态。加入不同浓度的MMP-9酶(图4a)后，观察到样品的颜色从红色到紫色的视觉检测。如图4b所示，随着MMP-9浓度在0-400 ng/mL范围内的增加，AuNPs在525 nm处的吸光度逐渐降低，而在660 nm处的吸光度逐渐增加。

  检测MMP-9酶的荧光响应

  另一方面，加入MMP-9酶抑制了AuNPs对AuNCs荧光的FRET猝灭效应，使AuNPs的荧光逐渐恢复。在紫外光照射下分析MMP-9的浓度，并用肉眼显示半定量的反应(图5a)。AuNCs的荧光强度在0-400 ng/mL范围内随浓度的增加而逐渐恢复(图5b)。为确定该方法的检测范围，考察了MMP-9浓度对ΔA和ΔF的影响。这里，ΔA=A660/525，分别对应于660 nm和525 nm处的吸收波长。此外，ΔF= (F–F0)/F0，其中F0是初始荧光发射，F是加入MMP-9酶后的荧光强度。ΔA与MMP9酶浓度在10~100 ng/mL范围内呈线性关系，符合线性方程y=0.0051x+0.3609，R2=0.98，检出限为2 ng/mL(图4c)。ΔF与MMP-9酶浓度在1~200 ng/mL范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=0.0471x+2.017(R2=0.97)，检测限为0.25 ng/mL(图5c)。如上所述，双模比色法和荧光法测定的最低检出限(LOD)分别为2 ng/mL和0.25 ng/mL，说明荧光法具有较高的灵敏度。血液中的MMP-9的正常水平在10-100 ng/毫升的范围内，在某些情况下，如癌症，升高的水平可能高达500 ng/毫升。因此，与我们得到的结果相比较，证实了所提出的方法在实际样品中检测MMP-9的适用性。对于酶的活性单位(U)的计算，正如对MMP-9酶的解释一样，每μg酶等于1U，因此，计算出MMP-9在比色法中的检测范围为0.01~0.1U，检出限(LOD)为0.002U。MMP-9在荧光法中的检测范围为0.001~0.2U，检出限(LOD)为2×10-4U。考虑到双模式检测，我们的应用策略证实了该方法检测MMP-9的有效性和灵敏度。与观察到的UV-Vis和荧光光谱变化一致，颜色在比色模式下从红色逐渐变为紫色和荧光亮度增加提供了肉眼对MMP-9的半定量检测，这表明所进行的实验作为目视分析工具的可行性。

  结论：

  1、基于AuNPs的SPR特性进行MMP-9酶的比色检测，基于AuNPs与AuNCs之间的FRET特性用于MMP-9酶的荧光检测。

  2、在MMP-9酶的存在下，明胶层降解并有效地抑制了AuNPs和AuNCs之间的FRET效应，导致AuNPs@明胶/AuNCs纳米复合材料的荧光和吸光度发生了显著变化。

  3、该平台通过比色检测模式提供了对MMP-9酶的可视化检测。荧光强度和吸光度与MMP-9酶浓度呈良好的线性关系，为检测MMP-9酶提供了灵敏的方法。虽然比色模式显示出较高的检测下限，但它提供了肉眼检测MMP-9酶活性的方法。

  4、荧光模式和比色模式都可以帮助我们同时测定酶的准确活性。该方法在90 min的孵育时间内获得了比原有的酶联免疫吸附试验方法更好的效果。此外，该方法用于人血清实际样品测定，回收率良好。该方法为MMP-9酶的定量提供了方便、有效的工具。

  参考文献

  DADMEHR M, MORTEZAEI M, KOROUZHDEHI B 2023. Dual mode fluorometric and colorimetric detection of matrix metalloproteinase MMP-9 as a cancer biomarker based on AuNPs@gelatin/AuNCs nanocomposite. Biosensors and Bioelectronics [J], 220: 114889.