脂质介导Wnt蛋白稳定用于人类器官干细胞无血清培养

目前建立的来自肠道、胰腺、肝脏和其他人体器官的类器官培养物为疾病建模、药物开发、个性化药物以及基因和干细胞治疗带来了巨大的希望。类器官复制了许多器官属性，包括疾病症状及其对治疗的反应，其中干细胞的自我更新需要激活Wnt途径，在小鼠器官中通过Wnt增强子R-pondin1扩增内源Wnt信号来实现。相比之下，人类类器官则需要额外的Wnt配体，由含血清的培养基培养的能够产生Wnt3a的细胞系提供。大多数Wnt蛋白在无血清介质中活性较低。纯化的Wnt3a蛋白由于疏水性使其在培养液中迅速失去活性，而它的增溶需要一种干扰干细胞自我更新的洗涤剂CHAPS。因此未经处理的Wnt蛋白不适用干细胞无血清培养（图1）。研究表明，Wnt蛋白对磷脂小泡有很高的亲和力，可以在无血清情况下延长Wnt蛋白的活性（图2）。因此本文证明了疏水的Wnt3a蛋白与可溶性脂质载体，包括脂质体和疏水纳米颗粒(NPs)的结合提高了其稳定性（图3），使得其现在没有血清和CHAPS的情况下支持器官干细胞扩增（图4、5）。消除了阻碍干细胞临床应用的主要障碍，并为Wnt3a蛋白在所有细胞培养中的应用提供了优势。

图1 Wnt3a蛋白的不稳定性以及洗涤剂相关的毒性对干细胞培养产生不利影响。(a)在Wnt3a条件培养液或在含有纯化Wnt3a蛋白（400ng/mL）的无血清条件培养液获得的人十二指肠类器官。(b)扩增的ESCs能够形成未分化的碱性磷酸酶阳性(AP)集落。Wnt3a和培养液每天或在每次传代后更换。(c) Wnt3a (250ng/ml)在37℃孵育一定时间后保持活性，在无血清培养液中稀释。(d)能够形成AP+的ESCs扩增。Wnt3a和培养液每天更换。

图2 脂质介导稳定的Wnt3a蛋白在无血清培养中增强靶基因激活和胚胎干细胞扩增。(a)将脂质体（含终浓度250 ng/ml Wnt3a蛋白）在37℃无血清培养基中孵育一段时间后定量Wnt活性。(b) DMPC/DMPG/Chol 10: 1: 10脂质体在37℃孵育一定时间后，Wnt活性保持不变。(c)携带Wnt靶基因7xTcf-eGFP的ESCs在加入纯化或脂质体Wnt3a(250 ng/ml)后进行3天GFP成像，并在4天后进行流式细胞仪分析。(d)量化R1 ESCs在无血清培养中以克隆密度形成碱性磷酸酶阳性集落的扩增。指示试剂在每一次传代后加入。(e)ATP法检测人十二指肠类器官的扩增。

图3 替代脂质载体稳定Wnt3a蛋白。(a)测定Wnt3a蛋白在无血清条件下于37℃恒温孵育一定时间后Wnt活性的变化。除Wnt3a脂质体外，分别加入脂质体和纯化的Wnt3a蛋白。(b) 单个人十二指肠类器官细胞的扩增(第10代)可在Wnt3a(800ng/mL)存在下形成新的类器官。(c) Wnt3a在37℃的无血清培养液中孵育一定时间后仍保持活性。将DMPC包被的PLGA纳米粒子与Wnt3a预先孵育(PLGA-WNT3a)或同时加入Wnt3a (PLGA+纯化Wnt3a)。(d)在37℃(250ng/mL Wnt3a)下孵育一定时间后保持WNT活性。

图4 脂质稳定的Wnt3a蛋白支持多能干细胞的无血清增殖和自我更新。(a)单个人十二指肠类器官细胞的扩增(第7代)可形成新的类器官细胞。(b)在含有Wnt3a脂质体(400 ng/mL Wnt3a)的无血清培养中获得人十二指肠类器官。(c)定量RT-PCR分析在含有Wnt3a条件培养液或脂质体中衍生的第7代人十二指肠类器官中肠干细胞标志物LGR5和TROY的表达。(d)组织化学和免疫细胞化学染色，取自并保存在Wnt3a条件培养液或脂质体中的第6代人十二指肠类器官以及人小肠切片。Ki67、EPHB2和嗜铬粒蛋白A(CHRA)染色为棕色，碱性磷酸酶(ALPI)为蓝色，过碘酸-席夫(PAS)为紫色(见箭头)。(e) 人十二指肠类器官的共聚焦图像(Z-STACK投影)，提取并保存在Wnt3a脂质体中，然后分化5天或保存在扩增培养基中。红色为绒毛蛋白(VIL)和溶菌酶(LYSZ)，绿色为粘蛋白2(MUC2)和CHRA。细胞核用DAPI复染。

图5 Wnt3a脂质体支持人空肠和肝脏器官的无血清建立。(A)在含有Wnt3a脂质体(800 ng/mL Wnt3a)的无血清培养基中培养人空肠类器官。(B)，可含有Wnt3a脂质体(800 ng/mL Wnt3a)的无血清培养基获得从从患有(i)丙型肝炎合并肝细胞癌、(ii)a-1抗胰蛋白酶缺乏症和(iii)肝豆状核变性的患者活检中所产生的人肝脏类器官。