单细胞平行报告子实验检测细胞类型特异性基因调控

人类疾病的大多数可遗传变异映射到基因组的非编码部分，控制基因表达的顺式调控序列（CRSs）的遗传变异只在特定的细胞类型中发挥作用，所以人们对能够测量特定细胞类型的CRSs及其基因变体的影响的高通量分析有浓厚的兴趣。大规模并行报告基因检测 （MPRA） 是一系列技术，可让研究人员对CRS文库及其非编码变体进行整体检测。在MPRA实验中，每个CRS驱动一个在其3' UTR中携带独特DNA条形码的报告基因，这使得研究人员可以通过输出RNA和输入DNA中条形码丰度的比率来量化每个CRS的活性。这种方法使研究人员能够识别新的CRS、分析非编码变异的影响并发现控制CRS功能的一般规则。但MPRA的一个局限性是它们通常在单一培养物中进行或作为跨组织细胞类型的bulk分析。无法同时获得报告基因活性和细胞类型信息，因而不能用于细胞类型特异性调控元件的鉴定。

为了解决这个问题，作者开发了一种单细胞大规模平行报告试验（scMPRA）来测量顺式-同时跨越多种细胞类型的调控序列（CRS）。scMPRA同时测量单细胞中报告基因的活性以及使用单细胞转录组识别这些细胞的身份。scMPRA的关键组成部分是两级条形码方案，可从mRNA测量单个细胞中存在的所有报告基因的拷贝数。一个特定的条形码标记每个感兴趣的CRS（CRS条形码，cBC），第二个随机条形码（rBC）充当单细胞中报告基因DNA拷贝数的代理（图1）。rBC的关键在于它足够复杂，以确保相同的cBC和rBC在同一细胞中多次出现的概率微乎其微。在这种情况下，单个细胞中不同cBC-rBC对的数量成为该细胞中CRS拷贝数的有效代表。即使一个细胞携带多个不同CRS的报告基因，并且每个报告基因的拷贝数不同，仍然可以将每个细胞中的每个报告基因标准化为其质粒拷贝数。通过这种条形码方案，可以在单细胞分辨率下测量具有不同输入丰度的许多CRS的活性，满足能够同时测量不同细胞群中CRSs的活性。

作者在HEK293和K562细胞混合物中检测了核心启动子文库，结果表明scMPRA是一种可重复、高度平行的单细胞报告基因检测，可检测细胞类型特异性的顺式调节活性。然后，我们测量了活体小鼠视网膜中多种细胞类型的启动子变体库，并表明微妙的遗传变体可以对顺式调节活性产生细胞类型特异性的影响。综上所述，文章开发了一个可重复的高度平行的单细胞报告基因实验技scMPRA，它能够在单细胞分辨率水平测量不同丰度的CRSs的活性，从而同时评估不同种细胞群体的CRSs活性，预计将广泛应用于研究CRS在不同细胞类型中的作用。

图1 scMPRA能够在单细胞分辨率水平上检测CRS活性