一种独特的恒温核酸扩增技术——聚合酶螺旋反应(PSR)

单增李斯特菌可引起李斯特菌病，致死率高达20%-30%，已成为当今世界上致死率最高的食源性致病菌之一。即使严格遵守安全阈值，欧盟内部李斯特菌病的增加趋势突显了迫切需要开发一种专门、快速、方便和用户友好的方法来检测食源性病原菌。基于传统分离培养的检测技术耗时繁琐；基于免疫学的检测技术成本较高，并且灵敏度不高等。

聚合酶螺旋反应(PSR)是一种在水浴或金属浴中即可完成的恒温核酸扩增过程。由于PSR体系中含有大量的甜菜碱，一旦反应温度达到，DNA单链和双链处于动态平衡，在5’→3’DNA聚合酶和BstDNA聚合酶的存在下，引物与目标片段结合并完成核酸扩增。与其他恒温核酸扩增反应相比，如环介导的等温扩增(LAMP)和滚环扩增(RCA)等，PSR酶的用量更少，而且PSR的引物更易于设计，从而提高了反应的稳定性、敏感性和高特异性。PSR的产物可通过电泳法、荧光曲线和颜色指示剂(HnB、SYBR GreenӀ、钙黄素)进行检测。

本研究建立一种针对hlyA基因的PSR检测方法，用于检测人工鲜切水果中的单核细胞增多性李斯特菌。在这项研究中，PSR分析和HNB颜色指示剂成功地结合在一起，提供了快速准确的检测。并比较了该方法与PSR方法的特异性和敏感性。利用hlyA基因相同的保守区设计了引物，以防止在PCR和PSR分析中出现引物偏倚扩增产物用HNB的颜色信号可视化，并用凝胶电泳法和荧光放大曲线进行验证。建立了检测单增李斯特菌hlyA基因的标准化PSR方法，对不同试剂浓度和时间范围进行了测定，并对其进行了优化。为了进一步证实，还用实时荧光和2%琼脂糖凝胶电泳法对产物进行了鉴定。通过实时检测、目测和2%琼脂糖凝胶电泳法检测其特异性和敏感性。

采用PSR检测鲜切水果中单增李斯特菌，检出限为1×10⁴ ng/μ，人工污染样品为5.1×10¹cfu/g。与多酶系统相比，PSR分析将非特异性扩增和假阳性降至最低，提高了检测病原体的准确性和效率。

图1a.甜菜碱的PSR优化；b.dNTP的PSR优化；c.硫酸镁的PSR优化；d.引物比例的PSR优化(主引物：加速引物)。

图2.a.荧光曲线测定PSR的分析灵敏度；b.2%琼脂糖凝胶电泳法测定PSR的分析灵敏度。1-6：10⁰ ng/μL、10^-1 ng/μL、10^-2 ng/μL、10^-3 ng/μL、10^-4 ng/μL、10^-5 ng/μL；M道：2000BP标记；N道：阴性对照)；c.用2%琼脂糖凝胶电泳法测定聚合酶链式反应的灵敏度(1-6管：10⁰ ng/μL，10^-1 ng/μL，10^-2 ng/μL，10^-3 ng/μL，10^-4 ng/μL，10^-5 ng/μL)；d.用2%琼脂糖凝胶电泳法测定聚合酶链式反应的灵敏度(1-6管： 10⁰ ng/μL，10^-1 ng/μL，10^-2 ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4 ng/μL，10^-5 ng/μL；M管：2000bp标记；N管：阴性对照)。

图3.a.荧光曲线测定PSR的分析特异性；b.2%琼脂糖凝胶电泳法测定PSR的分析特异性(第1-6区：单核细胞增多性乳杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、福氏葡萄球菌；M区：2000个碱基标记；N区：阴性对照)；c.HNB测定PSR的分析特异性(第1-6管：单核细胞增多性乳杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、福氏葡萄球菌；N管：阴性对照)

图4.a.荧光曲线PSR检测人工污染样品中的单核细胞增多性李斯特菌；b.2%琼脂糖凝胶电泳法检测人工污染样品中的单核细胞增多性李斯特菌(通道1-6：5.1×10⁶cfu/g、5.1×10⁵cfu/g、5.1×10⁴cfu/g、5.1×10³cfu/g、5.1×10²cfu/g、5.1×10¹cfu/g、5.1×10⁰cfu/g；通道M：2000个碱基标记；通道N：阴性对照)；C.用HNB检测人工污染样品中的单核细胞增多性李斯特菌(试管1-6：5.1×10⁶CFU/g、5.1×10⁵CFU/g、5.1×10⁴CFU/g、5.1×10³CFU/g、5.1×10²CFU/g、5.1×10¹CFU/g、5.1×10⁰CFU/g；试管N：阴性对照)。

原文DOI: 10.1016/j.lwt.2024.115909