乳制品中食源性致病菌菌落和细胞水平快速鉴定的高光谱成像技术

根据美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention , CDC)的估计，每年有六分之一的美国人生病，导致12.8万人住院，3000人死亡。在美国，估计每年有760例病例和22例住院治疗病例与乳制品消费有关，主要由产志贺毒素的大肠杆菌(Shiga-toxin-producing Escherichia coli , STEC)、沙门氏菌、单核增生李斯特菌和弯曲杆菌引起。食源性暴发数量的增加加强了对快速病原体鉴定系统的需求。虽然传统的微生物检测方法是金标准，但这些方法费力、耗时，需要4 - 7天才能得出结果。目前采用的快速检测方法(免疫学或分子基础)需要复杂的仪器，密集的样品制备，昂贵的试剂，以及训练有素的操作和维护人员。因此，需要一种快速、准确、灵敏、经济的病原体鉴定系统，以便在早期发现病原体。

高光谱成像(Hyperspectral imaging , HSI)是一种快速、可靠、无损、样品制备少的微生物鉴定新技术。HSI技术结合了传统成像和光谱学，可以同时获取标本的空间(图像的x和y维度)和光谱特征(波长，λ)。在HSI中，标本图像通常在可见光/近红外区域(400 - 1000 nm)以特定的波长间隔采集。获取的空间和光谱信息被组合成一个被称为超立方体(x, y，λ)的数据集。根据样品的分子和化学结构，超立方体可以由吸收、反射、透射或荧光光谱数据组成。超立方体包含一堆二维图像，作为给定波长范围的函数，其中图像的每个像素包含其自己的完整光谱或独特的高光谱特征。根据研究类型，可以从超立方体中选择一个像素或一组像素[称为感兴趣区域(ROI)]来生成高光谱特征。这种高光谱特征是快速识别给定标本的独特指纹。例如，给定细菌集落或细胞的高光谱特征可以存储在参考库中，以后可以通过匹配高光谱特征来识别未知样品。

高光谱成像系统是通过工程调整，将GoldenEye™快照高光谱成像仪安装在B3223三目镜暗场显微镜上，高光谱成像仪通过USB端口连接到计算机，而将这两种技术集成到一个功能系统中(图1a)。然而，用于获取菌落水平高光谱数据的HSI系统与用于获取细胞水平数据的系统相似，但没有显微镜(图1b)。该HSI系统包括安装在相机支架上的高光谱成像仪，一台控制相机并获取图像的计算机，以及一个fiber - lite DC950照明卤素光源，该光源与光纤面积板灯连接，从底部照射琼脂平板(图1b)。在图像采集过程中，用专门设计的黑色纸箱覆盖细胞或群体级成像系统，以消除任何背景噪声。

图1. 分别在细胞水平和菌落水平获取高光谱数据的高光谱成像系统

通过对菌株各自属内的所有菌株/血清型的高光谱特征进行平均化获得菌株平均高光谱特征。不同属在菌落水平上的高光谱特征区分明显，不同致病菌在700 ~ 750 nm范围内的峰值散射强度值存在明显差异(图2a)。另一方面，在细胞水平上，大肠杆菌和沙门氏菌的高光谱特征表现出明显的重叠，但单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的高光谱特征差异是可识别的(图2b)。不同病原体在细胞水平上的峰值散射强度范围为725 ~ 750 nm(图2b)。

图2. 测试菌株参考文库在菌落水平和细胞水平400 – 1100nm波长范围内的标准化高光谱图

表1. 分类算法对全脂牛奶样品中测试菌株菌落水平上的分类精度

表2. 分类算法对全脂奶粉样品中测试菌株菌落水平上的分类精度

对于全脂牛奶和全脂奶粉样品，在菌落水平上对单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的分类准确率为100%。同样，对于沙门氏菌（除伤寒沙门氏菌），两种乳制品在菌落水平上的分类准确率均达到100%。全脂牛奶样品对六大非O157 STEC（除O26）的分类准确率为100%；在全脂奶粉样品中，对大肠杆菌O26、O121和O145的分类准确率分别为83.33%、83.33%和66.67%，而大肠杆菌O45、O103和O111的分类准确率达到100%(表2)。在全脂牛奶样品中，大肠杆菌O157:H7准确率在66.67 - 83.33%之间，而在全脂奶粉样品，大肠杆菌O157:H7菌株43,895和35,150的分类准确率最差，为16.67%(表2)。

表3. 分类算法对全脂牛奶样品中测试菌株细胞水平上的分类精度

表4. 分类算法对全脂奶粉样品中测试菌株细胞水平上的分类精度

在细胞水平上的分类结果如表3和表4所示，全脂牛奶和全脂奶粉中的大肠杆菌O157:H7菌株在细胞水平上的分类准确率为33.33% ~ 66.67%。在全脂牛奶样品中，六大非O157 STEC的分类准确率从33.33%到83.33%不等；而在全脂奶粉样品中，六大非O157 STEC（除O45）分类准确率为33.33%。对于全脂牛奶样品中的沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的分类准确率最高，达到50%，但对于其他血清型，分类准确率在16.67%至33.33%之间。在乳制品样品中，单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌菌株的分类准确率较差。