Nat. Chem. Biol│最小化靶标扩增的干扰以实现CRISPR的快速和灵敏检测

摘要：尽管基于CRISPR的检测具有巨大潜力，但它在现场和家庭检测方面很难与其它市场诊断产品竞争。在这里，作者剖析了影响Cas12b和Cas13a介导检测性能的限制因素。在一锅法检测中，Cas12b通过结合并切割扩增子干扰环介导等温扩增，而Cas13a则直接降解病毒RNA，减少其扩增。作者发现，工程化的与原间隔序列邻近基序相互作用域的Cas12b可以用于一锅法检测，灵敏度提高10到10,000倍，成功实现了85个SARS-CoV-2临床样本中的准确检测，灵敏度为^{0.5 cp μl−1}，使其优于野生型Cas12b。同时，通过减少Cas13a与病毒RNA的相互作用，优化的基于Cas13a的检测在室温下30分钟内检测了87个SARS-CoV-2临床样本中的86个，灵敏度为0.5 cp μl−1。拓宽的反应条件和改进的CRISPR检测性能使它们在病原体检测中具有更强的竞争力。

图：一锅法检测图摘。

结果与讨论

1.一锅法检测使用Cas12b的次优PAMs

在之前的研究中，作者发现在一锅法检测中Cas12a的切割可能会干扰等温扩增，通过调整Cas12a的次优PAM的切割动力学可以大大增强检测的灵敏度和重复性。为了确定这种次优PAM方法是否可以扩展到其他Cas12同源物的一锅法检测，作者比较了AapCas12b的典型PAM序列和次优PAMs的性能。作者使用三个针对SARS-CoV-2 N基因的间隔序列评估了18个次优PAMs。与Cas12a观察到的结果不同，使用AapCas12b的次优PAMs的间隔序列得到的荧光曲线与使用典型PAMs相比并没有表现出更优越的性能。无论使用LAMP还是RPA作为等温扩增方法，情况都是如此。作者推测，调整AapCas12b的PAM序列（TTN）可能不如LbCas12a（TTTV）那样适应性强，甚至AapCas12b的PAM中的一个单核苷酸突变都可能严重损害其活性。

2． 结构引导的Cas12b突变一锅法检测

作者假设通过替换Cas12b的PAM相互作用域内的残基，以调节其活性进而改善一锅法检测。为了提高Cas12b介导的CRISPR检测的灵敏度和速度，作者使用了已知的AacCas12b-单导向（sg）RNA-双链DNA三元结构作为工程化AapCas12b的指导，鉴于它们之间有显著的保守性（图1a,b）。与底物形成氢键的AapCas12b的氨基酸被突变为丙氨酸，并且在LAMP介导的一锅法检测中根据它们的表现选择了性能优于野生型（WT）的突变体（图1c,d）。在比WT表现出更强荧光信号的突变体中，鉴定出了一个共同的G478A突变，并且具有双突变G478A/K396A的突变体产生了最强的信号（图1c,d）。作者将这种改良的AapCas12b命名为‘Cas12b-2M’，并使用各种间隔序列在LAMP介导的一锅法检测中评估了其性能。在所有三个检测的间隔序列中，与WT相比，Cas12b-2M显示出加速的动力学（图1e–g），导致灵敏度提高了10到10,000倍，并且信号噪声比显著增强（图1h–j）。值得注意的是，甘氨酸478在多个物种的Cas12b家族中是保守的，而赖氨酸396在AapCas12b和AacCas12b之间表现出保守性，这表明这些突变可能潜在地适用于其他Cas12b同源物。

图1：a, AapCas12b-WT和AapCas12b突变体介导的一锅法检测中等温扩增和切割过程的示意图。b, AacCas12b中与PAM和DNA相互作用的残基的插图。c,d, LAMP介导的一步法检测中AapCas12b-WT和突变体的荧光轮廓。e-g, 使用N基因间隔序列1(e)、间隔序列2(f)或间隔序列3(g)在LAMP介导的一锅法检测中WT和AapCas12b-2M的荧光信号。h-j, 使用WT或AapCas12b-2M进行一锅法检测的灵敏度比较。荧光值是使用SpectraMax i3x确定的。双链DNA底物分别为N基因间隔序列1(h)、间隔序列2(i)和间隔序列3(j)。

为了探索Cas12-2M如何改善一锅法检测，作者对Cas12b-WT和Cas12b-2M之间的切割活性进行了比较。作为对照，作者设计并表达了一种酶活性丧失的Cas12b-WT和Cas12b-2M，并通过实验验证它们的顺式切割活性已被消除（图2a–d）。与Cas12b孵育1分钟后，通过qPCR对未切割的底物进行了定量。值得注意的是，在这1分钟的时间内，经Cas12b-2M处理的样本中未切割产物的数量是经Cas12b-WT处理样本的7.4-44.4倍，这表明Cas12b-2M对等温扩增的初始步骤施加了较少的干扰（图2a–d）。此外，作者定量了一锅法检测期间产生的扩增子。与单独的LAMP相比，Cas12b-2M组显示出扩增子数量平均减少了6.8倍，而Cas12b-WT组则显示出大幅度的减少，扩增子数量比单独的LAMP少46-4420倍（图2e–h）。这一观察结果表明Cas12b-2M大幅减少了对LAMP过程的干扰。酶活性丧失的Cas12b-WT对阻碍扩增有轻微的影响，这可能源于其能够结合到底物并阻碍扩增过程。在酶活性丧失的Cas12b-2M组中，这种阻碍效应进一步减弱（图2f–h）。

图2：a, 顺式切割活性检测方法的示意图。b–d, 使用qPCR定量顺式切割。在60°C孵育1分钟后，使用qPCR定量了AapCas12b-WT和AapCas12b-2M中剩余的底物。使用了N基因间隔序列1 (b)、间隔序列3 (c)和间隔序列3 (d)的双链DNA底物。e,量化扩增子检测方法的示意图。f–h, 使用qPCR在一锅法检测中定量扩增子。双链DNA底物为N基因间隔序列1 (f)、间隔序列2 (g)和间隔序列3 (h)。

3. 使用Cas12b-2M检测SARS-CoV-2样本

为了进一步提高一锅法检测的效率，作者筛选了几种市售的枯草杆菌DNA聚合酶，这是LAMP反应中使用的唯一酶。选择Cas12b-2M结合最佳聚合酶，在15分钟内检测到伪SARS-CoV-2 RNA，检测限（LOD）低至0.5 cp μl−1。在评估SARS-CoV-2临床样本时，Cas12b-2M检测了所有85个样本，灵敏度达到100%（图2i,j）。相比之下，Cas12b-WT的灵敏度为77.6%，检测了85个样本中的66个（图2i,j）。单独的LAMP显示出大量的假阳性和假阴性。使用Cas12b-2M的一锅法检测产生的信号与临床样本检测的RT–qPCR Ct值没有显示出强烈的负相关性（图2i）。为了减少潜在的交叉污染，作者将dUTP和尿嘧啶-DNA N-糖基水解酶（UNG）纳入一锅法检测。在临床环境中，UNG通常被优先选择以提高检测准确性。作者观察到UNG在不同临床样本中的一锅法检测中显示出不同程度的干扰。这种差异性抑制可能促成了前面提到的弱负相关性。综合这些数据表明，Cas12b-2M在一锅法检测中的表现优于Cas12b-WT。

4. 基于Cas13a的REVERSE检测方法的开发

作者的目标是开发一种无需温控装置的基于CRISPR的检测方法，使其在家庭检测中与广泛使用的抗原检测方法竞争。鉴于Cas13a显示出比Cas12同源物更强的反式切割活性，这表明即使在低于最佳温度的条件下，也有可能使用Cas13a进行CRISPR检测。结合RPA和LwaCas13a的一锅法检测被开发出来用于检测SARS-CoV-2。这种方法，名为SHINE，涉及使用RPA逆转录引物将病毒RNA逆转录为互补DNA（cDNA），然后使用包含T7启动子序列的前向引物进行cDNA扩增（图3a）。然后，扩增的DNA在体外转录为RNA，随后被LwaCas13a识别以触发其反式切割活性。据报道，SHINE对鼻咽拭子样本的灵敏度范围为^{100–1000 cp μl−1}，反应时间为37°C下的40分钟。

作者注意到在体外转录（IVT）过程中合成的RNA与SHINE中的病毒RNA具有相同的序列（图3a）。作者推测病毒RNA也可以被Cas13a识别和切割，并且连续的序列扩增可能会受到干扰。确实，作者发现在一锅法检测中，逆转录和RPA过程被Cas13a介导的切割严重破坏（图3b,c）。为了减少对扩增的干扰同时保持Cas13a的反式切割活性，作者开发了一种新方法（REVERSE）。在REVERSE中，使用短引物从病毒RNA逆转录cDNA。随后，使用包含T7启动子序列的反向引物进行扩增。这种安排确保了从DNA扩增子转录的RNA与病毒RNA反向互补，从而为Cas13a介导的切割提供了序列特异性（图3a）。支持这一点的是，扩增子在REVERSE中在5分钟内变得明显，并随后积累，而SHINE中的扩增子在10分钟后观察到，并且随时间的积累最小（图3b）。当将逆转录反应和Cas13a混合在单一管中，并通过qPCR追踪cDNA的丰度时，REVERSE组中的cDNA量与无CRISPR-RNA（crRNA）对照相当。这大约是SHINE中实现的水平的十倍（图3c）。综合这些数据表明，在REVERSE中，Cas13a没有干扰底物的逆转录。

作者继续评估REVERSE和SHINE对SARS-CoV-2检测的有效性。值得注意的是，REVERSE比SHINE快10分钟达到最大荧光值，其信号值是SHINE的2.5倍（图3d）。为了直接比较REVERSE和SHINE之间的检测限（LOD），两种一锅法检测在相同的输入体积、样本浓度、反应体积和反应时间的相同条件下进行。REVERSE能够一致地检测到^{1 cp μl−1 RNA}样本，这比SHINE（^{100–1000 cp μl−1}）敏感100-1000倍（图3e）。当使用SARS-CoV-2的伪病毒作为底物时，观察到了类似的趋势。在将REVERSE应用于检测SARS-CoV-2的临床样本时，它忠实地检测了所有17个SARS-CoV-2 RNA样本，特别是那些具有相对较高的Ct值，范围从29.1到35.9（图3f）。

图3：a, 逆转录、RPA（重组酶聚合酶扩增）、IVT（体外转录）和CRISPR介导的检测过程的示意图。b, REVERSE和SHINE中的扩增子积累。c, 在Orf1ab IVT RNA上逆转录（RT）与LwaCas13a切割之间的竞争。d, REVERSE和SHINE的荧光轮廓。e, REVERSE和SHINE之间的灵敏度比较。

4. 优化REVERSE用于室温条件

基于CRISPR的检检测验通常需要从37-60°C的升高反应温度，而基于抗原的检测则在室温下进行。尽管基于CRISPR的一锅法检测快速且灵敏，但加热设备的需求引入了更高的成本，并阻碍了其在与抗原检测相当的广泛应用。为了评估REVERSE在较低温度下工作的可行性，作者在23至37°C下进行了REVERSE检测。REVERSE能够在23°C的蓝光下在45分钟内检测到伪SARS-CoV-2 RNA（图4a）。随后，作者优化了REVERSE，目标是在室温下在30分钟内检测到病毒RNA。为了实现这一目标，作者调整了引物组和荧光猝灭剂的浓度（图4b,c）。这些修改的结合显著加快了REVERSE的反应速率，使其在20°C下在30分钟内产生了强的信号（图4d）。REVERSE的修改版本，被称为REVERSE-2，在20°C下在30分钟内有效地检测到了低浓度的伪SARS-CoV-2 RNA（^{0.5–5 cp μl−1}）。

图4： a, 在不同温度下的REVERSE检测。b–d, 通过增加引物剂量(b)和荧光猝灭剂浓度(c)来优化20°C下的REVERSE。d, 检查优化条件。e–h, 使用REVERSE-2对87个SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样本进行检测的结果，包括63个提取的RNA样本和24个未提取的样本(e,g)，以及20个SARS-CoV-2 RNA阴性样本(f,h)。i, 比较107个样本的RT–qPCR和REVERSE-2结果的一致性表格。

5. 使用REVERSE-2检测SARS-CoV-2样本

为了评估REVERSE-2在20°C下检测临床SARS-CoV-2样本的适用性，作者检测了87个Ct值在22.2到37.6之间的SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样本，以及20个阴性样本。REVERSE-2显示出98.9%的灵敏度和100%的特异性，能够在室温下30分钟内检测到Ct值为37.6（相当于0.5 cp μl−1）的SARS-CoV-2样本（图4e–i）。值得注意的是，可以通过蓝光和智能手机上的相机捕捉到阳性信号，这一特性使REVERSE-2可以作为家用直接自我检检测剂盒使用（图4e,f）。

作者在20°C或25°C下检测了由Cas13a、Cas12a和Cas12b介导的优化CRISPR检测。虽然REVERSE-2在20°C下30分钟内产生了可检测的信号，但Cas12a在25°C下显示出非常微弱的信号，而Cas12b没有产生任何信号。这一观察表明，Cas效应物的不同酶活性也有助于在低于最佳温度下检测结果。

最后，作者对REVERSE-2和市售的SARS-CoV-2抗原检测在室温下的速度、检测限（LOD）和特异性进行了直接比较。抗原检测的周转时间为15分钟，其LOD相当于RT–qPCR中的Ct值为27.5。相比之下，REVERSE-2的LOD对应于RT–qPCR中的Ct值为37.3，展示了比抗原检测大约500–1000倍的灵敏度。这两种检测都没有与其他两种病毒——单纯疱疹病毒1型和人类巨细胞病毒——发生交叉反应，表明它们具有高度特异性。

讨论

作者之前的研究显示，使用次优PAMs（原间隔序列相邻基序）的靶向底物可以加速一锅法检测，并提高检测限和可靠性。Cas12a通过在一锅法检测期间迅速降解扩增子来阻碍扩增过程。相反，当使用次优PAM减少顺式切割时，扩增子会迅速积累，从而触发Cas12a的反式切割能力。尽管次优PAMs与Cas12a有效配合，但它们不适用于Cas12b和Cas13，因为这些酶有更简单的PAM或没有PAM要求。通过对Cas12b的PAM相互作用域进行蛋白工程，实现了等温扩增和底物切割及/或结合的重新平衡，从而促进了LAMP介导的一锅法检测。这种方法有潜力应用于各种Cas效应物，以增强基于CRISPR的核酸检测能力。

基于CRISPR的检测在临床诊所的现场诊断中具有潜力。对于这类应用，当与CRISPR搭配使用时，LAMP比RPA更适合，因为LAMP由单一酶组成，而RPA需要三种酶，使LAMP在制造方面成为更简单的选择。LAMP最佳工作温度为60°C，需要一种嗜热的Cas蛋白，如AapCas12b，以便在一锅法检测中进行核酸检测。提高基于LAMP的CRISPR检测的灵敏度和速度对于促进其在现实世界中的使用至关重要。与Cas12b-WT和单独的LAMP相比，作者的Cas12b-2M表现出更优越的性能，使其成为临床应用的有力候选者。

作者开发了一种无需加热的基于CRISPR的方法，用于超灵敏和快速检测SARS-CoV-2。在这种方法中，作者减少了Cas13a在一锅法检测中与目标RNA扩增过程的干扰。这种战略设计有效地利用了Cas13a强大的反式切割活性，使得在短时时间内实现室温下基于CRISPR的病毒样本检测成为可能。REVERSE-2检测可以在20–37°C的一系列室温下，在30分钟内检测到低至^{0.5 cp μl−1}浓度的病毒样本。RT–qPCR所展示的显著灵敏度和准确性为诊断包括SARS-CoV-2在内的各种病毒设定了黄金标准。值得注意的是，疾病控制和预防中心指南中为qPCR设定的阈值在^{0.5–1 cp µl−1}的范围内。REVERSE-2实现了^{0.5 cp µl−1}的检测灵敏度，与顶级RT–qPCR试剂盒的性能相符。虽然RT–qPCR检测需要专业知识、昂贵的基础设施和较长的样本到答案的持续时间，但REVERSE-2在没有这些复杂性的情况下提供了相同水平的灵敏度。REVERSE-2的高灵敏度部分归因于Cas13与RNA底物扩增的无干扰，以及逆转录过程的简化设计。作者比较了几个人类冠状病毒的N基因序列与逆转录引物、扩增引物和针对SARS-CoV-2的Cas13a–crRNA靶向序列。很明显，这些序列，特别是crRNA靶向序列，显示出相对较低的同源性，表明REVERSE方法具有高度特异性。

基于抗原的COVID-19试剂盒因其快速和自我检测能力而广受欢迎。虽然这些试剂盒提供了方便和可负担性，但它们的灵敏度明显较低，比RT–qPCR检测低100到1000倍。这一限制导致大量无症状和有症状的携带者收到假阴性结果。各种设计用于检测SARS-CoV-2核酸的自我检测试剂盒已获得美国食品药品监督管理局和其他政府当局的批准。尽管它们的灵敏度更高，但核酸检检测剂盒的使用量仍然远低于抗原检测，部分原因是它们的成本大幅提高。需要加热和温度控制设备，通常由USB适配器供电，这增加了这些试剂盒的生产成本。虽然将工程化的Cas13a与电化学传感器结合使用有潜力将反应时间缩短到30分钟或更短，同时提高灵敏度，但与电化学传感器生产和规模化相关的成本限制了其广泛采用。此外，CRISPR的一个关键应用是在野外病原体检测领域，那里并不总是能保证持续的电源供应。值得注意的是，REVERSE-2绕过了对加热和温度控制设备的需求，其灵敏度显著超过了抗原检测，同时保持了相似的检测速度。

CRISPR介导的检测的灵活性，结合其简单性、准确性、超高度灵敏度、速度和独立于温度控制的优势，使得诊断可以用于现场应用和家庭检测的多种病原体检测。此外，作者相信，增强的LAMP介导的CRISPR检测有望在临床环境中超越单独的等温扩增，鉴于其卓越的灵敏度和特异性水平。。

参考文献：Tong, X.; Zhang, K.; Han, Y.; Li, T.; Duan, M.; Ji, R.; Wang, X.; Zhou, X.; Zhang, Y.; Yin, H. Fast and sensitive CRISPR detection by minimized interference of target amplification. Nature Chemical Biology 2024, 20 (7), 885-893. DOI: 10.1038/s41589-023-01534-9.