一种基于合成噬菌体高灵敏度检测大肠杆菌O157的方法

大肠杆菌O157是一种重要的食源性和水源性病原体，能引发爆发性和散发性疾病。感染这种细菌会导致严重疾病，如出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合征。尤其是在美国，每年约有63,000例由大肠杆菌O157引起的感染病例。

传统的培养方法，如选择性琼脂平板和生化测试，通常需要3至7天才能获得结果。分子方法（如PCR）虽然提供了快速且灵敏的检测，但需要专门的设备和专业知识，成本也高于基于培养的方法，且无法区分活菌和死菌。

噬菌体因其高度特异性和只感染活细菌的能力，在特定细菌检测中受到了关注。噬菌体检测方法的高灵敏度、特异性和准确性已在一些细菌（如大肠杆菌、肠球菌和克雷伯氏菌）的尿样检测中得到验证。通过基因改造，噬菌体的检测灵敏度可以进一步提高。例如，将萤光素酶基因引入大肠杆菌O157噬菌体中，通过同源重组生成嵌合噬菌体，用于细菌检测。

合成噬菌体的开发旨在解决传统噬菌体工程方法的局限性，如时间消耗和繁琐的筛选过程。通过体外组装和重启合成噬菌体基因组，可以灵活设计和构建噬菌体。本研究中，通过体外组装合成了一个针对大肠杆菌O157的特异性噬菌体vB_Eco4M-7，并进行了验证和应用测试。

近日，日本东京新宿区国立传染病研究所药物和疫苗开发研究中心Kotaro Kiga团队在Communications Biology期刊上发表了题为：Synthetic phage-based approach for sensitive and specific detection of Escherichia coli O157的论文。

该研究旨在开发一种基于体外组装的vB_Eco4M-7噬菌体的合成方法，并将其用作大肠杆菌的验证。该研究首先从vB_Eco4M-7噬菌体中提取基因组DNA，通过PCR获得DNA片段，并设计使相邻DNA片段重叠的引物，然后通过重叠区域体外组装这些DNA片段，并将其电转化到大肠杆菌HST08中，以重启噬菌体。在开发和优化检测系统时，研究人员在vB_Eco4M-7的几个蛋白上添加了HiBiT标签，选择最适合检测灵敏度的插入位置，通过光度测量检测HiBiT标签的发光，评估噬菌体的杀菌活性和检测能力。

图1 体外合成E.coli O157噬菌体，其基因组为68 kb。a）O157_vB噬菌体合成的图解。从噬菌体基因组中扩增出具有重叠区的DNA片段，并在体外进行组装。将组装好的产物电穿孔至E.coliHST 08.大肠杆菌中表达。噬菌体最终在细菌内部重新启动，并通过感染E.coli O 157在平板接种前添加到样品中。b）11-氨基酸肽（HiBiT）标签和所用DNA片段的插入位点的图示。用含有HiBiT序列的PCR引物扩增O157_vB噬菌体，在gp 37（次要衣壳蛋白）或gp 64（裂解酶）的C-末端带有HiBiT标签。每份样品制备8个片段。比例尺表示1 kb。c）评估天然和HiBiT标记的O157_vB噬菌体对18个大肠杆菌的裂解活性。

使用HiBiT标记的vB_Eco4M-7噬菌体，测试其对大肠杆菌O157的检测灵敏度和特异性，并检测了多个临床分离株，评估了该方法的适用性。将检测标签连接到尾纤维蛋白的C末端，gp 27在所测试的20个插入位点中产生最大的检测灵敏度。构建的噬菌体检测大肠杆菌O157的所有53个不同的临床分离株，清楚地将它们与35个非O157产滋贺毒素大肠杆菌的临床分离株区分开来。该方法可应用于其他病原菌的多种应用，包括基于噬菌体的检测和噬菌体治疗。

图2 用hibit标记O157_vB检测大肠杆菌O157。利用合成O157_vB噬菌体检测大肠杆菌O157。检测了4株O157大肠杆菌和5株非O157大肠杆菌。噬菌体/细菌培养物孵育2小时后测定其发光。开始感染多重性(Multiplicity of infection, MOI)为1。下限设定为100相对光单位(RLU)。

为了评估HiBiT标记的O157_vB对在大肠杆菌O 157检测中，研究人员接下来使用O157_vB_{HiBiT（gp 27）}检测了来自8个不同进化枝的53个STEC O 157临床分离株以及跨越11个不同O-血清型的35个非O157 STEC临床分离株的检测。大肠杆菌O 157的噬菌体感染性在菌株之间不同，但与噬菌体感染性非常相关。具体地，属于进化枝3的所有O157分离株被O157_vB无效地杀死，并且具有相对低的发光水平，这可能是由于对进化枝3特异性的抗噬菌体防御系统，例如DarTG 59和Zorya I型60。当用O157_vB_{HiBiT（gp 27）}感染非O157 STEC菌株时，没有样品发射发光，表明检测系统是高度特异性的。O157和非O157 STEC的发光水平的比较证实，合成的O157_vB_{HiBiT（gp 27）}可以清楚地区分这些细菌。

图3 检测E.coli O157临床分离株。a）53株O157和35株非O157 STEC分离株的检测试验。将每种临床分离株与O157_vB_{HiBiT（gp27）}在初始MOI为1下孵育2 h，并测量培养物的发光。下限设定为100 RLU。结果显示为单个重复样品（n = 3）和平均值（SD）。大肠杆菌O157临床分离株根据其进化枝而不同地着色。B）O157_vB感染性与检测灵敏度的关系。采用简单线性回归分析了EOP对发光水平的影响。c) O157_vB检测的特异性。比较了53个O157和35个非O157 STEC分离株之间的发光水平。使用Welch t检验对两组比较结果进行分析。

综上所述，该研究开发了一种基于HiBiT标签的快速检测系统，合成的vB_Eco4M-7噬菌体能在2小时内高特异性地检测大肠杆菌O157，并能够区分非O157 STEC菌株。此外，该合成噬菌体的方法不仅适用于大肠杆菌O157，还可以扩展到其他致病细菌的检测和治疗应用，为食品安全提供了新的工具。

论文来源：https://doi.org/10.1038/s42003-024-06247-w