基于发光噬菌体的肺炎克雷伯菌检测：从工程到诊断

肠道微生物组时管理或预防慢性炎症性疾病的重要因素，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为一种引起严重感染的病原菌，对多种抗生素具有耐药性，使得传统治疗愈加困难。噬菌体（细菌病毒）疗法近年来因抗生素耐药性问题重新受到关注，它通过特异性识别并杀死细菌，对人体正常菌群影响较小，且能够进化以对抗细菌抗药性。尽管噬菌体疗法在生产、纯化、人体免疫反应及监管审批上面临挑战，但已有临床试验和个案研究显示其在治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染方面的潜力，为解决抗生素耐药性问题提供了一种有效的替代或辅助治疗手段。然而常用的双层平板法费时费力不符合快速检测的要求。在这种背景下基于噬菌体基因组工程的发光噬菌体被开发出来，它能够实时监测细菌的存在和数量，提供高灵敏度的检测，并具有良好的特异性。

作者使用传统的同源重组方法将荧光素酶基因nluc敲入野生型噬菌体的基因组中，使其仅在目标细菌感染时表达。他们选用了Mcoc (Podoviridae家族中的Drulisvirus噬菌体，基因组为44 kb)和8M7 (Siphoviridae家族中的噬菌体，基因组为115 kb) 靶向KP2H7，通过基因组注释算法和LC/MS，作者确定了Mcoc和8M7的主要衣壳蛋白，并设计了噬菌体靶向载体(PTV)，在插入点的噬菌体序列上分别插入约500 bp的5 '(上游同源区(UHR))和3 '(下游同源区(DHR))的序列，将带有PTV质粒的KP2H7用野生型噬菌体感染，产生重组和野生型噬菌体基因组的混合物，通过一系列的富集手段最终将单个发光噬菌体分离出来。但由于这种方法不能使噬菌体8M7的信噪比大于10，作者通过将操纵子插入五个不同的基因组位置来确定最佳基因组克隆位置再进行噬菌体富集分离。

在此，作者通过两种不同的克隆策略，利用不同的基因结构和基因组插入位点成功的培育出了两种发光噬菌体，并利用已知不含内源性KP2H7的五种不同的粪便样品进行检测验证，同时通过改变不同粪便储存条件来测试发光噬菌体获得的KP2H7信号来证明了发光噬菌体的潜力和直接测试粪便样本的可行性，提供了一种有效的肺炎克雷伯菌检测手段。为日后慢性病治疗领域的发展特别是与肠道微生物群失衡相关的疾病提供了指导。

原文doi: 10.3390/bios12030153