罗伊氏乳杆菌DS0384通过人肠道类器官和婴儿小鼠的后生效应促进肠道上皮成熟

关于微生物群在早期肠道发育中的调节能力知之甚少。基于人类多能干细胞衍生的人类肠道类器官（hIO），研究了对肠道微生物代谢物做出反应的各种肠道模型：生理相关的体外胎儿样肠道、肠道干细胞和肠道疾病模型。作者利用具有未成熟胎儿特征的3D hIO模型发现新分离的罗伊氏乳杆菌菌株DS0384可以加速胎儿肠道成熟。比较代谢组学分析表明，分泌的代谢物N-氨基甲酰谷氨酸（NCG）参与了DS0384无细胞上清液对hIOs肠道成熟的有益作用。在肠干细胞球体模型和基于hIO的肠道模型中进行的实验表明，含有NCG的DS0384的无细胞上清液可促进肠道干细胞增殖，对于保护肠道免受细胞因子诱导的肠上皮损伤非常重要。还评估了DS0384的益生菌特性，包括酸和胆汁耐受性以及粘附人类肠道细胞的能力。口服DS0384和无细胞上清液7天可促进新生小鼠肠道发育。此外，NCG对小鼠实验性结肠炎具有保护作用。这些结果表明，DS0384是益生菌应用和治疗早期肠道发育障碍和预防肠道屏障功能障碍的有用药物。具体实验结果如下：

图1

相较于其他三株罗伊氏乳杆菌，DS0384显著增加了hIO的表面积(图1b)，hIO的萌芽数量(图1c)以及成熟肠道特异性标记物在mRNA和蛋白质水平的表达（图1a, d）

根据成熟肠道特异性基因表达的显著增加和形态学的变化，发现 hIO 的成熟在DS0384无细胞上清液（CFS）后期（收集时间6、12、18 和 24 h）得到促进（图1e-h）。即DS0384的CFS中存在活性成分。

图2

DS0384的CFS中有14种代谢物的含量高于罗伊氏乳杆菌KCTC3594T型和罗伊氏乳杆菌DS0195（图2a ）。

培养前七种差异分泌代谢物监测hIO的变化，显示N-氨甲酰谷氨酸（NCG）增加了hIO出芽数量、扩大了类器官表面积和形态（图2b-d），对肠成熟具有最大的影响，通过NCG增加了肠道成熟标志物的表达（图2b, e）。

图3

利用DS0384的CFS处理了由ISC和肠祖细胞组成的3D InSexp，评估DS0384衍生的代谢物对肠道再生的影响。

DS0384提取的CFS中含有的代谢物显著增加了3D InSexp的大小、存活细胞数（图3a-c）。

增加了ISC标记基因（如CD44、OLFM4、SOX9、LGR5和ASCL2）的表达水平（图3d）。

与对照组和 KCTC3594T 提取的CFS相比，用DS0384提取的CFS处理 3D InSexp后， Ki67阳性增殖细胞和CD44阳性 ISC 细胞明显增加（图 3e）。

图4

研究了DS0384衍生代谢物可以防止病理条件，如干扰素γ（IFNγ）/TNFα诱导的肠道炎症和屏障损伤（图4a），发现IFNγ/ TNFα处理72 h后，肠损伤相关的细胞表型：出芽尺寸减小（图4b），炎症细胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα）的表达显著增加（图4c）；与IFNγ/TNFα处理组相比，DS0384衍生的CFS及其代谢物NCG能维持hIOs正常的肠上皮结构（图4d-e），且显著减少炎症细胞因子（图4c）。

染色进行组织学分析，结果显示DS0384衍生的CFS和NCG处理可减少类器官的破坏，并保留hIOs上的粘液层（图4f）；肠上皮屏障完整性相关的ZO-1的表达和定位恢复到接近对照水平，Ki67阳性增殖细胞显著增加（图 4g）。

图5

益生菌候选标准之一是胃肠道（GIT）的高存活率。发现DS0384显示出对pH值低至3.0的耐受性，存活率为100%（图5a）；在3%胆汁盐中的存活率超过200%（图5b）。

在细菌粘附试验中，1.55%的DS0384细胞粘附在Caco-2细胞单层上，是参考型菌株KCTC3594T和LGG的8.51倍和1.80倍（图5c）。

DS0384可以在人类肠上皮细胞中存活和生长24h，形成正常肠道生理模型，包括各种肠细胞类型，以及在需氧和厌氧条件下细菌粘附的粘蛋白相关基因/蛋白的功能和表达（图5d）。

图6

口服DS0384活菌或其CFS的小鼠在出生后第12天显示绒毛长度、绒毛面积和空肠隐窝深度显著增加；结肠的隐窝深度和粘膜与粘膜下层的比率增加（图6b）。

对空肠和结肠的粘液层和粘液分泌杯状细胞进行了染色，口服DS0384活菌或其CFS显著增强了粘液分泌，并且粘液生成细胞（杯状细胞）的分化与对照组不同（图6c）。

喂食 DS0384 活菌 3 天的产后小鼠组中发现了罗伊氏乳杆菌特异性的 PCR 产物。FISH 检测呈阳性，即 DS0384 在结肠组织中被检测到（图6d-e） 。

RNA-seq数据集的层次聚类分析显示，与喂食PBS或KCTC3594T的CFS的小鼠相比，喂食DS0384 CFS的小鼠肠道中与肠道分化和成熟相关的基因上调（图6f）；肠道发育相关基因也显著增加（图6g）。

图7

暴露于DSS四天后， NCG 组的体重下降速度慢于 DSS 对照组（图7b）；与对照组相比，NCG组出现的腹泻和血便反应较少。

NCG组的结肠长度保持在对照组水平，肠道粪便呈颗粒状（图7c），服用NCG可减少DSS引起的组织学改变（图 7d）。NCG 对 DSS 引起的结肠炎有保护作用。

结论：

新分离的罗伊氏乳杆菌DS0384的无细胞上清液（CFS）中的代谢物N-氨基甲酰谷氨酸（NCG）能促进未成熟人类肠道类器官（hIO）模型的成熟；

肠干细胞球体模型和基于hIO的肠炎症模型中发现含NCG的CFS可促进肠干细胞增殖，并保护hIO免受IFNγ/TNFα诱导的炎症；

DS0384菌株不仅对幼年小鼠肠道成熟有促进作用，且对DSS诱导的小鼠结肠炎模型有保护作用；

该菌株具有耐酸，耐胆盐及可粘附肠细胞等益生菌特性，或可用于治疗早期肠道发育障碍。