一种基于改性三聚氰胺泡沫检测液体中大肠杆菌O157:H7的快速、高灵敏比色生物传感器

食品传播疾病是全球公共健康的重大挑战，其中大肠杆菌O157尤为令人担忧，因为它的感染剂量低且临床症状严重，具体包括腹泻病、出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合征等，甚至可能导致死亡。现有检测方法如培养基检测、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）和等温扩增法，然而检测时间长、成本高和操作复杂的问题，限制了其在现场快速检测中的应用。

近年来，纸基比色生物传感器因其操作简便、成本低和可视化检测的优点，引起了广泛关注。然而，传统的纸基比色法在检测灵敏度和准确性方面存在限制，尤其是在处理大体积样品和复杂基质（如食物和水）时。常规纸基ELISA检测受限于纸张的层状纤维结构，导致大分子和细菌难以有效穿透和扩散，影响检测结果的均匀性和灵敏度。

近日，美国加州大学生物与农业工程学院Gang Sun团队在ACS Sensors期刊上发表了题为：Rapid and Ultrasensitive Colorimetric Biosensors for Onsite Detection of Escherichia coli O157:H7 in Fluids的论文。

为了解决这些问题，该研究开发了一种基于改性三聚氰胺泡沫（melamine foam, MF）的新型快速超灵敏比色生物传感器。与传统平台不同，改性MF具有宏孔三维结构，允许大分子和细菌在结构中自由移动，从而显著提高了灵敏度和检测速度。研究目标是提供一种更高效、经济且适用于现场检测的大肠杆菌O157检测方法，以改善食品安全和公共健康监测。

首先，研究人员使用化学试剂对三聚氰胺泡沫进行修饰，以引入活性基团，从而提高其与抗体结合的能力，并制备修饰后的MF样品，通过固定大肠杆菌O157:H7抗体形成抗体修饰的MF膜（Ab@NHS@MF）。在细菌培养和样品制备过程中，培养大肠杆菌O157:H7，并通过离心和悬浮技术获得不同浓度的细菌悬液，制备模拟污染样品如含有已知浓度大肠杆菌的水和牛奶样品。在检测过程中，将一定体积的细菌悬液或污染样品加入传感器中，孵育30分钟以确保细菌与抗体充分结合，洗去未结合的细菌后，加入辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的二抗，并进行孵育和洗涤，随后加入显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, TMB），使HRP催化产生颜色变化。通过裸眼观察颜色变化实现初步定性检测，使用智能手机拍摄反应结果并通过图像处理软件分析颜色强度，实现定量检测。

图1 泡沫夹心ELISA（f-ELISA）的制备和使用示意图。(a)抗体的固定化和细菌的捕获。(b)添加HRP标记的二抗和酶底物TMB，以生成颜色信号，并使用智能手机获取图像。

其次，该研究通过建立标准曲线，利用线性回归分析细菌浓度与颜色强度的关系，以确定检测限。为了优化和验证实验，研究人员调整抗体和HRP的浓度、反应时间等参数，并进行对照实验验证传感器的特异性和灵敏度，同时评估传感器在不同样品体积和复杂基质（如牛奶和灌溉水）中的表现。在50至10³ cfu/mL的细菌浓度之间，比色测定的线性方程确定为y = 0.0749x + 26.499（R² = 0.989）。50 cfu/mL水平的大肠杆菌O 157：H7是肉眼可读的，而使用智能手机获取的图像并对来自Photoshop的f-ELISA传感器的图像进行进一步分析，可实现低至10 cfu/mL的检出限。最后，研究人员使用10%蔗糖作为稳定剂，对固定抗体的MF膜进行冷冻干燥处理，在4°C下储存传感器并定期测试其检测性能，以评估其长期稳定性。

图2 (a)检测大肠杆菌O 157：H7的MF介质的光学图像和校正曲线。 (b)在50 - 10³ cfu/mL范围内，比色法的线性方程拟合为y = 0.0749x+ 26.499（R² = 0.989）。

为研究f-ELISA在大肠杆菌实际应用中的效率，从加州当地的杂货市场采集了人工污染的牛奶样品和农业用水。将MF膜安装到注射器针袋中;将5 mL样品溶液加载到20 mL注射器中，并以10 mL/h的受控流速流过针中的MF。在10 cfu/mL的浓度下，用5 mL的样品体积可检测到大肠杆菌O 157：H7。随后的培养板试验证实了大肠杆菌O 157：H7在12 cfu/mL的浓度下，以SMAC为选择性鉴别培养基，检测农业水样中的大肠杆菌O 157：H7，其与生物传感器结果一致。TSA培养基中生长的细菌菌落表明农业用水中存在一些其他细菌菌株。该实例有效地证实了生物传感平台的特异性和精确性。结果表明，所研制的fELISA生物传感器检测大肠杆菌的结果可靠、准确大肠杆菌O 157：H7的复合基质中。

图3 (a)举例说明了大肠杆菌O157：H7在农业用水中，照片显示了由注射泵操作的快速流动装置。(b)不同浓度的大肠杆菌O157：H7，无菌农业用水和非无菌农业用水。(c)细菌培养物暴露于无菌和非无菌农业用水后的整个平板图像。

综上所述，该研究开发了一种基于改性MF的快速超灵敏比色生物传感器，用于现场检测大肠杆菌O157:H7。结果表明，该传感器在不到1.5 h内能够实现定量检测，裸眼可识别灵敏度为10 cfu/mL，智能手机辅助下可达5 cfu/mL，经过1 h富集后灵敏度进一步提高到2 cfu/mL。传感器的三维宏孔结构使其适用于大体积样品的检测，显著提高了检测灵敏度和速度，展示了在食品安全和公共健康监测中的巨大潜力，并为现场快速检测病原菌提供了一种高效、经济的解决方案。

论文来源：https://doi.org/10.1021/acssensors.3c02339