一种高灵敏快速检测传染病病原体的技术

摘要：为了消除耗费成本、时间、劳动力和试剂的 RNA 提取步骤，设计了一组捕获探针(CP)用于捕获和富集目标序列。设计并制作了集液滴生成、靶RNA数字RT-LAMP和结果分析于一体的微流控芯片。通过检测SARS-CoV-2验证了SCADL的性能，实现了10 copies/mL的检测限(LOD)，检测持续时间在1 h内。更重要的是，SCADL的过程只包括几个简单的操作。这种快速、灵敏、特异性和用户友好的方法是在受感染的携带者和环境中现场筛查传染性病原体的有前途的候选方法。

图1. SCADL方案示意图

SCADL 的步骤包括裂解和捕获(20 min)、液滴生成(10 min)、RT-LAMP(20 min)和分析(1 min)。通过与磁珠 (MB) 表面修饰的寡核苷酸探针(OP) 杂交，结合在磁珠 (MB) 表面的特定捕获探针 (CP) 捕获并富集目标序列。目标序列和 MB的复合体以及 RT-LAMP 的混合物被分散到超过 2×10⁴的液滴中。具有至少一个靶标拷贝的液滴可以产生扩增并在终点分析时产生荧光信号。通过计算带有荧光信号的液滴数量，可在1 min内完成目标的定量分析。

为了研究SCADL的定量能力，对浓度从1 copies/mL至10⁵ copies /mL的IVT样本进行了检测（图2）。所有浓度高于10 copies/mL的样品在液滴中都产生了荧光信号(图2a)。阳性液滴的百分比与样品的实际浓度(10 copies/ mL至10⁴ copies/mL)具有良好的线性关系(图2b)。一旦靶序列的拷贝数超过液滴数(2×10⁴)，结果将超出线性范围。可以稀释样品以获得准确的定量结果。作者比较了SCADL和RT-PCR的敏感性，检测的样本浓度从1 copies/mL至10⁴ copies/mL。浓度在100 copies/mL到10⁵ copies/mL之间的样品的CT值在38.78到25.44之间，表明RT-PCR中的LOD为100 copies/mL(图2c和图2d)，而SCADL中的LOD为10 copies/mL，相较于RT-PCR灵敏度提高了10倍。

图2.  SCADL检测N基因的性能分析。(a)不同浓度(1 copies/mL至10⁵ copies/mL)IVT样本的终点荧光图像(scale bar：200 μm)。(b)终点荧光图像结果中阳性液滴的统计。(C)RT-PCR检测IVT样品的实时荧光曲线(1 copies/mL至10⁵ copies/mL)。(d)IVT样品浓度与Ct值之间的线性关系。

为了进一步评估SCADL在处理不同体积样本时的性能，作者测量了体积从100 μL到5 mL的IVT样本(浓度分别为10 copies/mL和100 copies/mL)。每次检测中RNA超过10 copies的所有样品都产生阳性液滴(图3a)，而其他样品仅产生阴性液滴，无论样品体积为100 μL 或 5 mL。测得的浓度与目标的拷贝数相对应(图3b)，这表明，SCADL可以检测到体积高达5 mL甚至更大体积的样本，而传统的核酸提取方法只能从100-200 μL的样品中提取RNA。作者进一步评估了SCADL 在 SARS-CoV-2 检测中的性能。检测了RNA浓度为2.5×10² copies/mL至2×10⁵ copies/mL和NTC的商业标准样本，并将结果与RT-LAMP进行了比较。用SCADL检测的所有SARS-CoV-2标准样品均产生阳性结果，即终点图像中出现荧光液滴(图3c)。当标准样品低于 2×10⁴ copies/mL 时，测量的浓度对应于标准样品的实际浓度(图 3d)。对于浓度高于2×10⁴ copies/mL的样品，如2×10⁵ copies/mL，由于样品中RNA的拷贝数超出了液滴的数量，除非稀释，否则很难直接获得准确的定量结果检测到样品。此外，SCADL检测的所有结果与RT-LAMP的结果一致(图3e，f)。

图3. SCADL处理不同体积和不同浓度SARS-CoV-2样本的检测性能分析。(a)不同体积(10 copies/mL和100 copies/mL)样品的终点荧光图像(scale bar：200 μm)。(b)体积范围从100 μL到5 mL的样品的测量浓度。(c)标准样品的终点荧光图像，其RNA浓度范围为2.5×10² copies/mL至2×10⁵ copies/mL (scale bar：200 μm)。(d)标准样品的测量浓度。(e) RT-LAMP测试标准样品的实时荧光曲线。(f)标准样品浓度与阈值时间之间的线性关系。

为了研究 SCADL 的特异性，作者检测了四种人类冠状病毒(冠状病毒 OC43、冠状病毒 HKU1、冠状病毒 229E 和冠状病毒 NL63)、MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2和1份来自健康志愿者的拭子样本。在三次重复测定中，只有 SARS-CoV-2 样本产生阳性结果(带有荧光信号的液滴)(图4a、b)。其他四种人类冠状病毒、MERS-CoV、SARS-CoV样本和健康志愿者样本在检测中未引起交叉反应。这表明 SCADL 对于 SARS-CoV-2 的检测具有足够的特异性。

图4. SCADL在SARS-CoV-2检测中的特异性。(a)6个非特异性样本、1个健康志愿者样本和1个阳性标准样本的终点荧光图像(scale bar：200 μm)。(b)上述所有样本的定量浓度。(P0：阴性标本，P1：冠状病毒OC43，P2：冠状病毒HKU1，P3：冠状病毒229E，P4：冠状病毒NL63，P5：MERS-CoV，P6：SARS-CoV，P7：SARS-CoV-2)。

总结：

1. 开发了一种基于特异性的捕获探针捕获并富集靶RNA的方法，取代了繁琐的RNA提取流程，降低核酸检测成本。

2. 通过检测SARS-CoV-2的 N 基因验证了SCADL 的性能，结果表明该方法具有超灵敏性、特异性、可量化性、快速性和用户友好性，并且能够大大减少对昂贵设备和技术人员的依赖。

3. 预计SCADL策略可以广泛应用于传染病的控制和预防，以及生物医学研究和临床诊断中的定量分析。

参考文献：

Jiang L, Lan X, Ren L, et al. Single-molecule RNA capture-assisted droplet digital loop-mediated isothermal amplification for ultrasensitive and rapid detection of infectious pathogens[J]. Microsystems & Nanoengineering, 2023, 9(1): 118.