手性纳米团簇作为替代治疗策略，应对抗生素耐药性病原体对健康的威胁

DNA是生命的基本遗传物质，在细胞核中以染色质的形式存在，控制着生物体的遗传信息传递和表达。DNA的双螺旋结构和碱基互补配对原理是其发挥功能的关键。DNA的复制和表达过程受到严格调控，但也可能发生突变，导致遗传疾病或癌症。目前，DNA研究已广泛应用于基因工程、分子诊断等领域。然而，DNA研究和应用仍面临一些挑战。例如，DNA的复杂结构和功能调控机制尚未完全阐明，对某些罕见突变的检测和解读仍有困难。此外，DNA操作技术的安全性和伦理问题也需要关注。重要的是，现有的DNA分析方法在灵敏度、特异性和适用性方面仍有提升空间，难以满足不同检测场景的需求。因此，开发更高效、更精准的DNA研究和应用技术，对于推动生命科学研究和改善人类健康具有重要意义。

基于此，中国科学院生态环境科学研究中心研究者提出了一种通过赋予银纳米颗粒（AgNPs）手性并调整其大小来构建手性银纳米团簇（AgNCs）的策略，以提高其生物靶向性和调节抗菌药物耐药性。如图1A所示，研究人员构建了手性AgNCs，并在体外和体内研究了它们对铜绿假单胞菌的抗生素活性。结果表明，手性AgNCs在抑制细菌耐药性方面表现出显著效果。这项工作通过开发手性纳米团簇，为应对日益严重的抗菌素耐药性威胁提供了替代治疗策略。

图1. 检测原理图

研究人员通过改进先前的合成方法，制备了三种银纳米团簇（AgNCs）：左旋（L-AgNCs）、右旋（D-AgNCs）和消旋（L-/D-AgNCs）。首先对合成的AgNCs进行了表征，证明其成功合成。透射电镜（TEM）结果显示三种AgNCs的平均尺寸均在2.4-3.0nm左右，晶格间距对应于Ag0的（111）晶面。紫外-可见光谱未观察到表面等离子体共振峰，进一步证实了纳米团簇的超小尺寸。随后评估了AgNCs的物理化学性质。Zeta电位测试显示三种AgNCs均带负电荷，有利于其稳定性。圆二色谱（CD）证实了L-AgNCs和D-AgNCs的手性，而L-/D-AgNCs几乎无手性。X射线光电子能谱（XPS）和质谱分析表明AgNCs主要由Ag0组成，每个团簇含22-29个银原子和半胱氨酸分子。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定三种AgNCs的银含量均在45-47%左右。这些表征结果全面证实了手性AgNCs的成功合成，为后续研究其抗菌活性奠定了基础。该合成方法具有良好的可控性和重复性，可用于制备不同手性的纳米材料。

图2. L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的表征。（a）L-agnc的代表性TEM图像及尺寸分布。L-agnc的平均尺寸为2.7±0.2nm。（b）D-agnc的代表性TEM图像和尺寸分布。D-agnc的平均尺寸为3.0±0.2nm。（c）L-/D-agnc的代表性TEM图像及尺寸分布。L-/D-agnc的平均尺寸为2.4±0.2nm。（d）L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的吸收光谱。制备的agnc在~420nm处没有观察到表面等离子体峰，表明颗粒尺寸超小。（e）L-agnc，D-agnc和L-/D-agnc在水溶液中的ζ电位。L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的值分别为-62.7±0.9mV、-60.9±2.7mV和-73.6±3.4mV。（f）L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的CD谱。（g）L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的XPS光谱显示，Ag3d3/2在374.3~374.5eV和Ag3d5/2在368.2~368.5eV的峰属于Ag0。（h−j）2，5-二羟基苯甲酸中L-agnc、D-agnc和L-/D-agnc的MALDITOFMS分析。

研究人员使用多种方法研究了银纳米团簇（AgNCs）和银离子（Ag（I））对铜绿假单胞菌的抗菌机制。首先对合成的AgNCs进行表征，证明其成功合成。然后通过SYTO-9/PI染色和MDA渗漏测定法检测细菌膜的通透性，结果表明AgNCs和Ag（I）均可增加细菌膜通透性，其中Ag（I）效果最强，手性AgNCs次之。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察显示，AgNCs处理后细菌表面出现塌陷和“坑”，而Ag（I）处理导致细胞内容物释放和细胞质膜边界模糊。膜电位测试表明AgNCs和Ag（I）不改变细菌膜电位。活性氧（ROS）检测显示，只有Ag（I）处理显著增加细菌ROS水平，而AgNCs不引起ROS增加。添加抗氧化剂谷胱甘肽可显著增加Ag（I）处理细菌的存活率，证实ROS在Ag（I）杀菌中的作用。综上所述，手性AgNCs和非手性AgNCs主要通过增加细菌膜通透性发挥抗菌作用，而Ag（I）的抗菌机制包括破坏细菌膜完整性和诱导细胞内ROS产生。这项研究为理解AgNCs的抗菌机制提供了重要依据。

图3. L-agnc、D-agnc、L-/D-agnc和Ag（I）离子的抗菌机制。（a）通过铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的存活率评估atibacterium的活性。1），其中L-agnc、D-agnc、L-/ddagnc或Ag（I）离子孵育后样品的OD600值除以未接触Ag的铜绿假单胞菌的OD600值。（b）pi阳性细胞的定量数据（传代号；1）.（c）P. aeruginosa培养基中细胞外MDA的相对水平。1）以5.45μmolAg/L浓度的L-agnc、D-agnc、L-/D-agnc或Ag（I）离子处理。未处理对照组的水平归一化为1.0。（d）具有代表性的SEM图像显示铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）明显的塌陷和损伤。1）以5.45μmolAg/L浓度的L-agnc、D-agnc、L-/D-agnc或Ag（I）离子处理后，对照样品形貌完整，表面光滑。（e）铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的相对膜电位（传代号；1）LAgNCs、D-AgNCs、L-/D-AgNCs和5.45μmolAg/LAg（I）离子处理。未处理对照组的水平归一化为1.0。采用diSC3（5）荧光法测定膜电位。（f）相对活性氧水平铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）1）以5.45μmolAg/L浓度的L-agnc、D-agnc、L/D-agnc或Ag（I）离子处理。未处理对照组的水平归一化为1.0。（g）添加谷胱甘肽对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）存活率的影响。1）以5.45 μmolAg/L浓度的L-agnc、D-agnc、L/D-agnc或Ag（I）离子处理。

研究人员评估了细菌对合成的银纳米团簇（AgNCs）的潜在耐药性。他们使用实验进化方法，研究铜绿假单胞菌对左旋（L-AgNCs）、右旋（D-AgNCs）、消旋（L-/D-AgNCs）和银离子（Ag（I））的连续暴露反应。

首先对合成的AgNCs进行表征，证明其成功合成。然后通过连续传代培养，确定细菌对AgNCs的耐药性发展。结果表明：

1. L-/D-AgNCs处理5代后，细菌存活率逐渐增加，9代后抗菌效果几乎消失，MIC增加5倍以上，表明产生了可遗传的耐药性。

2. L-AgNCs和D-AgNCs处理20代后，细菌存活率无明显变化，说明对手性AgNCs未产生耐药性。

3. 膜通透性和膜电位测试显示，耐药菌株对L-/D-AgNCs的敏感性降低。

4. 全基因组测序发现Rhs基因突变可能与L-/D-AgNCs耐药性相关，通过调节细胞壁形态产生影响。

5. 鞭毛蛋白和银流出泵相关基因未发现显著变化。

这项研究证明了手性AgNCs在抑制细菌耐药性方面的优势，为开发新型抗菌剂提供了重要依据。该方法具有广泛的应用前景，可用于研究其他纳米材料的抗菌机制。

图4.铜绿假单胞菌对L-/D-agnc的耐药性分析（a）对L-/D-agnc的抗性曲线。（b）铜绿假单胞菌对L-/D-agnc的遗传抗性。（c）第1代和第9代pi阳性细胞的定量数据变化。（d）L-agnc和L-/D-agnc在5.45μmolAg/L浓度下处理铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）第9代的相对膜电位。未处理对照组的水平归一化为1.0。（e）L-agnc、D-agnc、L-/D-agnc和5.45μmolAg/LAg（I）离子处理1代铜绿假单胞菌后活细胞中银的含量。（f）经L-agnc、D-agnc、L-/D-agnc和5.45μmolAg/LAg（I）离子处理后，第9代铜绿假单胞菌活细胞中银的含量。（g）具有代表性的SEM图像显示，P. aeruginosa在连续暴露于L-/D-agnc超过9代后，在没有银压的情况下重新引入MH肉液（即图b中第10代的细胞），但在对照组中观察到完整的形态和光滑的表面。

研究人员评估了手性银纳米团簇（AgNCs）对哺乳动物细胞的细胞毒性。首先使用小鼠表皮细胞JB6作为代表，验证了左旋（L-AgNCs）和右旋（D-AgNCs）的细胞毒性。结果表明：

1. L-AgNCs在高达87.2μmolAg/L（MIC的5倍）浓度下对JB6细胞无明显毒性，表现出良好的细胞相容性。

2. D-AgNCs随剂量增加表现出细胞毒性，在87.2μmolAg/L浓度下JB6细胞存活率降至约65%。

3. 在H460、HEK293和RAW264.7细胞中观察到类似结果，证实L-AgNCs的低细胞毒性。

4. 细胞摄取实验显示，JB6细胞对D-AgNCs的摄取量（537ng/106cells）约为L-AgNCs（293ng/106cells）的2倍。

5. 粗粒度分子动力学模拟表明，L-AgNCs与细胞膜磷脂分子间的范德华力相互作用（-597.4kJ/mol）强于D-AgNCs（-454.3kJ/mol），导致L-AgNCs与膜结合更强，更难穿透细胞膜。

这些结果证明了L-AgNCs优异的细胞相容性，为其作为抗菌剂的潜在应用提供了重要依据。该研究方法全面评估了纳米材料的生物安全性，可为其他纳米材料的毒性研究提供参考。

图5.L-agnc和D-agnc对体外细胞毒性的不同影响。（a）LAgNCs和D-AgNCs处理后JB6细胞的存活率。（b）501.6μmolAg/LL-agnc处理后JB6细胞的活力比。（c）32.7μmolAg/L的L-agnc和D-agnc对JB6细胞银的摄取。（d）L-agnc与细胞膜的初始相互作用结构。（e）D-agnc与细胞膜的初始相互作用结构。银、硫、氮、磷、碳、氢和氧原子分别显示为紫色、亮黄色、蓝色、暗黄色、青色、白色和红色的珠子。（f）手性agnc与膜的相互作用能。负值表示引力相互作用，coull和VDW分别表示库仑相互作用和范德华相互作用。

研究人员通过小鼠模型全面评估了左旋银纳米团簇(L-AgNCs)治疗铜绿假单胞菌感染伤口的体内疗效。实验首先对合成的L-AgNCs进行了表征，证实其成功合成。随后将L-AgNCs、传统抗生素左氧氟沙星和PBS对照分别应用于感染伤口。结果显示，L-AgNCs在多个方面表现出优异的治疗效果：显著促进伤口愈合，效果优于左氧氟沙星和PBS;最有效地减少细菌负担并抑制免疫反应；体内银残留量低且治疗后迅速清除；有效降低血清炎症因子水平至接近健康状态；组织学分析证实L-AgNCs处理的伤口炎症反应最轻微，无不良增生现象；促进伤口组织广泛形成胶原蛋白，加速愈合过程。值得注意的是，L-AgNCs在40次传代培养中未观察到明显耐药性。这些综合结果证明L-AgNCs在治疗铜绿假单胞菌感染伤口方面具有优异的抗菌活性和良好的生物相容性，为临床应用提供了新的选择。该研究通过全面评估纳米材料的体内疗效，为开发新型抗菌剂提供了重要依据和创新思路。

图6.L-agnc在铜绿假单胞菌感染慢性伤口愈合小鼠模型中的实用性。（a）三个治疗组在整个观察窗口的伤口照片。L-agnc、左氧氟沙星或PBS局部应用于铜绿假单胞菌感染的慢性伤口的性能试验时间表。（b）L-agnc、左氧氟沙星和PBS治疗的伤口面积随时间变化。（c）第7天，L-agnc、左氧氟沙星或PBS处理的铜绿假单胞菌感染伤口的平均菌落形成单位（cfu）。（d）第7天L-agnc或PBS处理小鼠模型器官的银浓度。（e−g）小鼠模型不同时间血样中IL-1β、IL-6和TNF-α的血清水平。（h）第7天lagnc、左氧氟沙星或PBS处理铜绿假单胞菌感染创面组织的H&E染色。蓝色箭头表示角质层角化不全；灰色箭头表示角质层角化过度；黄色箭头表示棘皮；绿色箭头表示结缔组织；橙色箭头表示血管；红色箭头表示炎症细胞浸润。数据点以均数±标准差报告（n=3）。*与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）。

本研究成功开发了一种基于手性银纳米团簇（AgNCs）的创新抗菌策略，通过赋予AgNCs手性成功调控其抗菌性能和生物相容性。研究发现，与非手性AgNCs相比，手性AgNCs对铜绿假单胞菌表现出优异的抗菌效果，即使在40代传代培养后仍未观察到明显耐药性。特别是左旋AgNCs（L-AgNCs）展现出良好的细胞相容性，无明显细胞毒性。体内实验进一步证实L-AgNCs在促进伤口愈合、减少细菌负担和抑制炎症反应方面表现优异。该方法创新地利用手性纳米材料与病原体进行对映体选择性相互作用，为延缓细菌耐药性提供了新思路。这项研究不仅为开发新型抗菌剂提供了可能性，也为解决细菌耐药性问题提供了创新方法，有望在临床应用中延缓耐药性的发展，具有广阔的应用前景。

论文链接：https：//pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.3c13044