使用蛋白质包裹的金纳米簇对细菌进行现场护理鉴定

近年来，基于“化学鼻/舌”策略的阵列传感器在细菌诊断领域备受关注。这种方法利用多个非选择性受体产生的总体特征来区分分析物，克服了传统“锁与钥匙”检测的局限性。然而，现有平台在探针合成和样品制备方面仍存在挑战。为此，研究人员开发了一种基于蛋白质模板金纳米团簇（AuNCs）的荧光传感器阵列，作为鉴定细菌的“化学舌头”。该方法选用人血清白蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白等蛋白质模板AuNCs作为传感探针，利用它们与细菌表面的特异性相互作用，实现了对不同细菌的高效区分。这种传感器阵列通过产生独特的指纹样图案，为快速、准确地鉴定和分类多种细菌提供了新的途径，有望在细菌感染诊断领域发挥重要作用。

基于此，中国科学院化学生物学实验室和稀土资源利用国家重点实验室的研究者提出了一种基于蛋白质-金纳米团簇（AuNCs）的荧光传感器阵列，作为鉴定细菌的“化学舌头”。如图1A所示，选择了HSA-、Lf-和Lyz-模板化的AuNCs以及万古霉素功能化的HSA-AuNCs （Van-AuNCs）作为传感探针。HSA-AuNCs基于其表面的肽基序与细菌细胞壁之间的相互作用，Lf-AuNCs则利用细菌对乳铁蛋白受体的高亲和力，Lyz-AuNCs通过识别细菌细胞壁上的肽聚糖来杀死细菌，而Van-AuNCs对细菌细胞壁上的D-Ala-D-Ala二肽具有强亲和力，使其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表面均有一定结合能力。不同细菌表面的物理化学性质变化会引起与传感器阵列的不同相互作用。孵育后，蛋白质-AuNCs包裹在细菌表面，通过离心后随细菌沉淀，上清液中蛋白质-AuNCs的荧光强度会根据细菌种类有所减弱。这些AuNCs的化学多样性使其对不同细菌表面产生反应，从而形成具有选择性的传感器阵列。由传感器阵列产生的独特指纹样图案允许对不同种类的细菌进行区分和分类（如图1B所示）。

图1 基于蛋白AUNC的细菌荧光传感器阵列示意图。A）在细菌存在下，蛋白AUNC的荧光强度显著降低。B）蛋白质- AUNC探针对细菌的不同反应产生的荧光图。

研究者合成了四种蛋白质-金纳米团簇（AuNCs），包括HSA-AuNCs、Lf-AuNCs、Lyz-AuNCs和BSA-AuNCs。首先，将HAuCl4溶液与四种蛋白质混合，搅拌5分钟后调整pH值至12，并在37℃下搅拌12小时。随后，通过碳二亚胺介导的方法将BSA-AuNCs与万古霉素偶联，得到Van-AuNCs。透射电镜图像显示四种蛋白-AuNCs的大小均为2-3 nm。X射线光电子能谱确认了AuNCs的化学状态，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示其结构完整性未受影响。荧光测试表明，蛋白-AuNCs在470 nm激发下发出610 nm的红色辐射，量子产率分别为4.7%、5.5%、4.9%和3.2%。通过与金黄色葡萄球菌孵育，研究了Van-AuNCs的结合亲和力，结果表明即使在低浓度下细菌也能被观察到，验证了细菌-Van-AuNCs偶联物的形成。

图2. A）与不同浓度的金黄色葡萄球菌共孵育1小时，6000 rpm离心5分钟后，在紫外线照射下记录的Van-AuNCs照片。B）不同浓度的金黄色葡萄球菌在阳光下6000 rpm离心5分钟后的照片。试管中金黄色葡萄球菌的浓度从左至右依次为:1.2 × 10¹⁰、4.0 × 10⁹、1.2 × 10⁹、4.0 × 10⁸、1.2 × 10⁸、4.0 × 10⁷、1.2 × 10⁷和0. C）从图（A）中每个样管的上清液中获得的荧光光谱。

更巧妙的是，研究人员进一步探究了蛋白质-金纳米团簇（AuNCs）对6种细菌的鉴别效果，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及其耐药菌株MRSA和KREC。这些细菌在临床感染中占据重要地位，因此快速准确地鉴定它们对于感染治疗具有重要意义。实验记录了AuNCs与细菌孵育后的荧光强度变化，每个样品进行了5次重复测试。随后，研究人员采用线性判别分析（LDA）方法对收集到的数据进行处理，这是阵列传感系统中常用的分类方法，通过最大化类间和类内方差的比值来实现细菌的分类。

图3. 基于蛋白ac荧光传感器阵列的细菌鉴定。A）在金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌、KREC、枯草芽孢杆菌和粪芽孢杆菌这六种不同细菌存在下，四种蛋白AUNCs的荧光变化模式（ΔI）。所有数值均以mean±SD表示（n = 5）。B）蛋白- AUNCs荧光阵列二维典型评分图。C）蛋白- AUNCs荧光阵列三维典型评分图。

之后，研究人员进一步研究了基于蛋白质-金纳米团簇（AuNCs）的荧光传感器阵列的细菌鉴别能力。所有原始数据未经预处理，转换为4个变量，并使用SYSTAT分析软件进行处理。结果通过二维和三维计分图表示，显示出4个典型因子（84.3%、9.9%、5.6%、0.2%），代表4个探针×6个细菌×5个重复的线性组合。二维和三维图清晰地显示出6个分离的簇，表明该传感器阵列可以精确识别细菌。

为了进一步研究细菌分析物的相似性，研究人员采用了层次聚类分析（HCA），根据数据点的欧氏距离对它们进行分类。HCA树突图清晰显示了六个不同的细菌簇，表明可以根据细菌对传感探针的亲和力来识别细菌。研究人员还测试了细菌及其耐药菌株的混合物，以金黄色葡萄球菌和MRSA为模型，混合物中MRSA的含量分别为0%、25%、50%、75%和100%。结果显示，荧光强度的变化依赖于混合物中耐药菌株的含量，LDA评分图清楚地显示了不同比例的混合物可以很好地区分。此外，研究人员从六种细菌中随机抽取未知样本，通过LDA分析荧光响应模式，验证了传感器阵列的稳健性。结果显示，未知样本的分类准确率为93.3%，进一步证明了该传感器阵列在快速鉴定细菌方面的潜力。

图4 A） 6种不同细菌的层次聚类分析树状图。B）金黄色葡萄球菌与MRSA不同比例混合物的典型评分图。MRSA的含量分别为0%、25%、50%、75%、100%。

最后，研究人员评估了所开发的基于蛋白质-金纳米团簇（AuNCs）的荧光传感器阵列在实际应用中的性能和潜力。他们采用Jackknife分类（逐步交叉验证分析）方法来确定传感器阵列中探针的最小组合，以获得足够的识别精度（图4A和表S3-S12，支持信息）。结果表明，单个探针对细菌的区分能力有限，但两个或三个探针的组合可以获得满意的分类精度。

研究人员进一步对由两个AuNC探针组成的传感器阵列收集的数据进行了线性判别分析（LDA）。在训练矩阵（2个探针 × 6个细菌 × 5个重复）内，分类准确率达到100%。生成的三个二维图清楚地显示，不同的细菌类型聚集在六个不重叠的组中（图4B-D），表明这些探针组能够有效区分六种不同的细菌样本。这些结果证实了该传感器阵列在实际细菌鉴定应用中的潜力。

图5. A） LDA得到的6种不同细菌jackknifned分类矩阵。由HSA-AuNCs和Lf-AuNCs组成的蛋白- AUNCs荧光阵列的典型评分图（B）， HSA-AuNCs和Lyz-AuNCs （C）， Lyz-AuNCs和Van-AuNCs （D））

本研究成功开发了一种基于蛋白质-金纳米团簇（protein-AuNCs）的荧光传感器阵列，作为鉴定细菌的“化学舌头”。该方法利用不同细菌表面的物理化学性质与传感器阵列产生的独特相互作用，生成类似指纹的响应模式，从而实现对不同种类细菌的区分和分类。研究表明，仅使用两个protein-AuNCs探针的组合就能达到100%的分类准确率，证明了该传感器阵列具有出色的诊断能力。这种创新的设计为快速、准确的细菌鉴定提供了新的方法，有望在资源有限的条件下实现即时细菌检测，为临床诊断和疾病预防开辟了新的途径。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adhm.201701370