铜绿假单胞菌的核酸扩增检测技术研究进展

PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。常规PCR简便快速、成本低，但稳定性差、假阳性高及容易产生非特异性产物，无法区分活/死细胞和判断微生物是否具有感染力等。Yongjun Tang等在预处理过程中采用磁珠富集、巢式PCR方法来获得高特异性的目标DNA片段。方梅等在PCR的过程中加入叠氮溴乙锭(EMA)与死细菌基因组DNA结合，可以有效地检测PA的活菌。qPCR在常规PCR反应体系中加入荧光探针或染料，通过扩增过程中荧光信号的累积来反映体系中模板浓度变化，可以定量检测混合样品中的的PA。Niikura等建立了一种基于23S rRNA的RT-qPCR的PA检测体系，以RNA为模板对PA进行定量检测。除此之外，通过不同的特异性引物和PCR方法还可以检测不同血清型和耐药型的PA。随着检测技术的不断发展，PCR检测的设备也在不断简化，成本也越来越低，灵敏性、特异性在不断提高，应用场景越来越广泛。

等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。目前用于检测PA常见的类型为：重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)。Takano等基于GES β-内酰胺酶基因（blaGES）建立了一种LAMP方法检测耐碳青霉烯类的PA。结果表明LAMP方法具有高度特异性，灵敏度是常规PCR的10倍。RPA相较于LAMP可在37~42 ℃恒温条件下，20 min内完成扩增反应，对检测设备依赖小，适合于现场DNA快速检测。RPA与CRISPR联用能提高检测灵敏度和特异性。Siyi Huang等基于Cas12a蛋白对核酸分子的靶向切割结合RPA技术建立了一种Cas12a-RCFL的检测方法，无需DNA纯化、快速、灵敏的检测PA。在INTA中引入了各种纳米材料，可以作为反应增强剂、信号放大器。此外，3D纳米材料还可以用作数字核酸扩增的隔离室和扩增产物的DNA测序工具。凭借高灵敏度、便携性好、检验条件要求低等特点，INTA技术成为继PCR技术后近些年受研究人员青睐的PA检测方法之一。

原文DOI：10.1039/c7ra09064a