基于LAMP-PDA的POCT比色系统实现奶牛场中大环内酯耐药金黄色葡萄球菌的灵敏检测

抗生素的使用在大大降低了全世界传染病的发病率和死亡率的同时，也带来了严峻的耐药性问题和环境污染问题。据统计，抗菌素耐药性（AMR）已造成了数百万人死亡。金黄色葡萄球菌（SA）是全球重点关注的三大耐药菌之一，可通过质粒、转座子、基因岛等进行耐药传播。AMR的传播使得临床用药治疗选择有限，又遇新药的研发速度迟缓，因而明确感染细菌及其耐药性对临床用药和限制AMR发展至关重要。目前，临床对此采取的主要措施仍然是基于培养的方法，以此评估菌落的形态学/生化特征和进行药敏鉴定（AST）。此技术简单易行，但是操作繁琐且耗时长，通常会延迟结果的报告。为加速报告时间，分子生物学技术得以采用，例如PCR，通过靶向特定的基因以实现在1-3 h内完成物种/耐药鉴定。其中，等温扩增技术因其免除了PCR的技术壁垒：精密的温控设备，近年来得到了广泛的关注，尤其是LAMP技术，其具备的比色检测特征使之成为了POCT检测方法的代表。现今，已有不少研究致力于基于pH响应的LAMP比色系统开发，尽管取得了一些进展，但是这些技术的灵敏度较差，且尚未经过真实场景的验证。基于此，Li等人报告了一种新型LAMP比色系统，此比色系统首次采用了生物传感器中常用的pH响应聚合物：聚二乙炔（PDA），通过在LAMP反应后加入此聚合物，联合智能手机分析比色结果即可实现耐药菌的POCT检测。考虑到当前对SA-大环内酯类药物的不足，及相关耐药基因存在于质粒、转座子和基因岛中，亦即耐药大环内酯SA的研究重要性，大环内酯类耐药SA被作为文章的研究对象。

简单说来，作者首先利用宏基因组分析筛选出了丰度高的大环内酯类耐药基因：macB；并从6个管家基因中筛选出特异性良好的SAOUHSC_01275作为SA种靶标基因。然后基于这两个选定的代表性基因，设计LAMP引物并对其验证。通过将PDA与常用pH指示剂：酚红和商业比色试剂盒的比较，展现出PDA作为pH响应指示剂的优越性（图2）。然后，对PDA浓度进行优化，验证其生物兼容性，并构建PDA-LAMP比色系统，对检测性能进行表征后应用于奶牛场大环内酯类耐药SA的现场检测（图3），大致内容见图1。所构建的PDA-LAMP比色系统对纯化基因组DNA检测时（智能手机可视化），检测限可低至1.344×10⁻⁷ ng/μL，比PCR高至少10倍。在对9例牛奶样本进行检测时，PDA-LAMP比色结果与凝胶电泳结果完全一致（图3），证明了PDA-LAMP系统作为耐药基因快筛工具的可行性。

综上，作者提出的PDA-LAMP比色系统的发展在POCT领域内具备很强的应用潜力。所使用的PDA比色材料，相较于其它pH指示剂，色域变化明显（冷色→暖色），具备更强的比色分析能力。方法的灵敏度也得到了一个突破，甚至比PCR还要高10倍。不过，仍有2点需要注意：①无法实现定量；②开盖带来的环境污染。当然，这两点不足或许会在未来得到妥善解决。总的来说，充分地挖掘所有可能性，对现有体系进行优化，以及明确macB基因的有效性和特异性，或将推动此技术真正走向实际应用。

图1 PDA-LAMP比色系统的开发内容总结

图2 （A）PDA、酚红和LAMP kit比色可视化结果比较；（B）图A中对应的R/G/B或者H/S/B三通道比色图像分析；（C）利用Image J图像分析ROI，得出阳性和对照样本的各颜色成分的绝对差值。（D）琼脂糖凝胶电泳结果和比色结果的对照分析（目标：macB）。M：2000 DNA ladder，1-5道：来自牛奶样本中的5个阳性单克隆基因；6道：阴性对照，SA 8325；7道：空白对照，无菌水。（E）琼脂糖凝胶电泳结果和比色结果的对照分析（目标：SAOUHSC_01275）。1-6道分别代表：SA 8325、SA 8325衍生物、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌。

图3 基于PDA-LAMP系统的macB基因的现场检测。（A）现场检测工作流程；（B）可视化结果与凝胶电泳结果的比较。