利用3D纳米结构拭子和基于深度学习的拉曼光谱实现多种食源性病原菌的同时鉴定

原创

来源：邹晶晶

2024-08-21 10:33:28

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核心提示：Hyunju Kang等人提出了一个应用于多种病原检测的策略，该技术集成了三维纳米结构拭子、便携式拉曼设备和深度学习分析。利用三维纳米结构拭子捕获病原菌，便携式拉曼设备采集被捕获细菌的拉曼信号以及深度学习算法对拉曼信号进行解析，此技术能够实现混合细菌样本中多种病原的同时鉴定，检测准确率接近100%。

据世卫组织统计，在全球范围内，因食品污染引起的患病事件高达6亿例，死亡人数高达42万。其中，一半以上的病例与细菌有关。因而快速、准确地识别食源性病原菌对于实施有效的补救措施和预防食源性疾病暴发至关重要。韩国食品和药物管理局（KFDA）推荐基于培养和聚合酶链反应（PCR）的方法作为检测食源性病原体的首选方法。基于培养的技术可以获得准确可靠的结果，但是耗时耗力，且需要考虑到病原生长条件，这些种种缺点都很可能延迟测试结果的可用性。PCR能够高灵敏、高特异地检测目标病原菌，但此技术通常涉及精密的温控设备和训练有素的工作人员。因而，可以说，尽管传统技术在促进食品安全和遏制食源性疾病方面发挥了重要作用，但它们本质上是回顾性的：事件发生后确定原因，而非事前预防。

积极管理食源性疾病是一个重要的公共卫生优先事项，而这涉及到食源性病原菌的定期和快速监测（几分钟）。目前，生物发光法（ATP）、免疫学等快检技术在检测食源性病原体方面取得了一些进展，但因其存在的低特异性、低精确度、低灵敏度性等缺陷，这些技术尚不能应用于现实环境。近年来，拉曼光谱技术因其无损和提供信息的相对全面性，已成为了病原鉴定领域内的一种明星技术。深度学习的加成，使之又近一步得到了发展。现今，已有不少研究报道了将深度学习或者AI智能与拉曼技术集成的检测技术，检测准确度较高，但是大多技术都瞄准的是单病原的检测，而这并不能与现实情况对标。当然，也有研究通过结合微流控技术展现了在血液样品中进行2种病原检测的潜力，但当运用于更多病原的混合样本时，检测性能明显下降。基于此背景，Hyunju Kang等人提出了一种应用于复杂混合样本中多病原检测的技术。通过集成①3D纳米拭子：无差别、非特异地捕获细菌（图2B）、②便携式拉曼设备：采集被捕获细菌的拉曼信号、③深度学习：基于一维卷积神经网络的二进制序列（CNN）的拉曼信号的解析，在5 min高效识别细菌种类，如图1，为改善食品安全监测提供了一个很有前途的解决方案。

在研究内容上，作者展示了3D纳米拭子的制备过程（图2 A），此种纳米材料并未修饰任何抗体或寡核苷酸，仅通过某些静电相互作用完成细菌的捕获（图2 B）。被捕获的细菌在633 nm波长和聚焦光斑尺寸为15 μM参数条件下采集拉曼信号。为保证拉曼信号采集过程的可靠性和一致性，将大肠杆菌O157：H7作为模型菌进行例证。通过系统的连续稀释法制备了8 ng/μL到80,000 ng /μL共5个不同浓度的样品，并收集这5个样本的拉曼信号（500次拉曼信号/样本）。结果显示，随着细菌浓度的增加，1465cm⁻¹处的拉曼信号强度明显上升（图2 C），且最强浓度的拉曼信号强度的相对标准偏差（RSD）较低（8.89%，图2D）。此现象显示了本方法或能定量细菌的能力，不过，更重要的是要明确检测到拉曼信号所需的最低细菌输入量。为此，作者制备了0.01至100 μg/μL共5个梯度的大肠杆菌O157：H7菌悬液，并进行拉曼信号检测。数据显示，在1465 cm⁻¹处的拉曼信号强度与大肠杆菌O157：H7（菌密度：0.1至100 μg/μL）存在很强的线性关系（R²值为0.95%），LOD为38.16 ng/μL（95%置信区间），如图2 E。这些发现证明了3D纳米拭子对细菌检测和定量的有效性。随后，作者引入了一个便携式拉曼设备（约80,000美元）以代替传统的大型拉曼设备，继而实现方法的可移动性和常规检测的可行性（图3 A）。为获得拭子上捕获细菌的全面的拉曼光谱信息，作者采用了4个拉曼信号收集单元（每个收集包含500个单独的拉曼信号），亦即每次实验收集2000个拉曼信号。另外，考虑到采集信号时存在的背景噪声干扰问题，作者引入了一个SG过滤器以使收集的拉曼信号平滑和强度归一化。在拉曼信号分析方面，作者采用了基于深度学习的二进制分类框架，使用多个一维CNN来分析细菌样本。此策略能够针对6个致病菌开发了6个不同的类符，每个类符都在训练和测试过程中独立运行，不会干扰其它运算（图3 B）。作为验证，作者分析了7种样本：不添加任何细菌样本（裸拭子）和分别添加6种目标致病菌（单一样本）。结果显示，所采用的深度学习模型能够以100%的准确率、精度和特异性实现6种细菌的分类（图3 C）。值得关注的是，CNN算法的一大优点是可以实现梯度加权类激活映射（Grad-CAM）。简单地说，就是能够呈现所解析拉曼信号的特征峰谱图。不过，并非简单地运用Grad-CAM，作者还对此采取了一些改进措施：关注到负梯度值。利用此改良版Grad-CAM，作者展示了对6种研究目标菌进行单重检测时的特征峰谱图（图3 D）。

在完成了单重检测的表征后，作者开始将此方法应用于混合样本的检测。在这里，作者观察到，混合样本的拉曼光谱图并非简单的单一光谱图的叠加，且观察到2个现象：①双重混合样本中，共有的菌的特征图几乎一致（图4 B），而其它细菌的特征图各有不同（图4 C），表明用于每种细菌鉴定的关键拉曼位移区域会在不同的点被激发，而具体的激发位置会因细菌种类而变化。②多重（≥2）混合样本中，比如二重和三重、三重和四重，哪怕是同一种菌，它们的特征图都有较大差异（图4 D-G）。通过这些现象，可以得出结论：混合种群细菌样本表现出不同的拉曼信号，而这与单一样本中观察的拉曼信号不同。因此，如果基于单重检测训练模型对混合样本进行检测，那么结果在准确度和精度方面必然会有所下降。为此，作者引入所有组合混合样本进行拉曼检测，并将拉曼信号和单重检测获得的所有拉曼信号放入深度学习模型进行重新训练和测试（9：1）。由此得到的结果准确度大大提高，如图4 A所示。

总的来说，作者系统地证明了方法应用于混合样本中病原检测的能力，且此方法具备经济（9美元/次）、便携、快速（5 min）、高效（6种细菌）的显著优势。相较于其它拉曼技术，本方法在混合样本的应用上显示出了优越性。另外，本方法使用的纳米拭子并未修饰任何成本昂贵的抗体或寡核苷酸，相较于其它样本富集或增菌实验，具有操作简单和经济性等优势。不过，反之，也因此使得捕获率相对较低。本文使用的深度学习网络在拉曼信号分析和结果判定中表现良好，不过，重复性还具有一定的上升空间。最值得考虑的是，文章更多的是围绕在细菌的鉴定上，在细菌的定量上尚未做出更多描述，这或许也是本研究在未来可以继续深入的一方面。

图1 利用3D纳米拭子和深度学习驱动的拉曼信号分析的食源性细菌的多重检测策略。3D纳米拭子棉签具有纳米形貌特征阵列，对细菌具有良好的诱捕效果。在三维纳米结构拭子上采集细菌的拉曼信号。提取光谱特征并用于深度学习模型训练，以此实现食源性病原菌的鉴别。

图2. （A）3D纳米拭子制造示意图。（B）食源性细菌在三维纳米结构拭子上的扫描电镜图像，显示了捕获细菌的形态和尺寸的异质性。（C）大肠杆菌O157：H7（1：8ng/μL，2：80ng/μL，3：800ng/μL，4：8000ng/μL和5：80000ng/μL）在3D纳米拭子上的拉曼光谱。（D）在1465cm⁻¹波段处获得的3D纳米拭子捕获的大肠杆菌O157：H7（输入密度：80,000 ng/μL）的500次拉曼光谱强度。RSD值为8.89%，表明拉曼信号的均匀性较高。（E）大肠杆菌O157：H7输入密度为0.1至100 μg/μL与在1465cm⁻¹波段处获得的拉曼强度之间的对数线性关系（R²=0.95%）。

图3. （A）利用3D纳米拭子捕获食源性细菌后的拉曼信号采集示意图。（B）基于深度学习的拉曼信号分析和物种鉴定。每个一维CNN都被训练用来识别与特定细菌物种相关的不同模式和光谱特征。（C）一维CNN模型对食源性细菌进行分类的混淆矩阵（行：真值和列：预测值）。深度学习模型在对食源性细菌种类和对照裸拭子进行分类方面显示了100%的准确性、精确度和特异性。（D）在3D纳米拭子上获得的食源性病原体拉曼光谱的Grad-CAM结果。红色阴影越深，识别相应细菌种类的特征就越重要。

图4.（A）一维CNN模型分类多个食源性细菌的混淆矩阵（行：真值和列：预测值）。深度学习模型在对多种食源性细菌种类进行分类时，显示出了近乎完美的准确性、精度和特异性。（B-G）在3D纳米拭子上获得的多种食源性病原体的拉曼光谱的Grad-CAM结果。蓝色或红色的阴影越深，该特征对识别相应的细菌种类就越重要。