利用三金属纳米酶信号增强能力以提升LFIAs对hCG的检测性能

摘要：发展超灵敏的横向流动免疫测定法(LFIAs)已经在护理点检测领域引起了极大的关注。在本研究中，通过在Pd@Pt核上沉积Ru合成了一种三金属树突状纳米酶(Pd@Pt-Ru)，并利用它来提高LFIAs的灵敏度。Pd@Pt-Ru检测H₂O₂的K_m值为5.23 mM，表明其对H₂O₂的亲和力与辣根过氧化物酶相当。钌表面层降低了活化能垒，提高了最大反应速率。作为概念的证明，提出的Pd@Pt-Ru纳米酶被纳入LFIAs (A-Pd@Pt-Ru-LFIAs)用于检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)。与传统的纳米金(AuNP)-LFIAs相比，A-Pd@Pt-Ru-LFIAs的灵敏度提高了250倍，裸眼检测限低至0.1 IU/L。真阳性率和阴性率均达到100%，这使得所提出的Pd@Pt-Ru纳米酶适用于临床样品中hCG的检测。

图1. Pd@Pt-Ru的合成及其在LFIA中的应用。

图1展示了通过元素沉积法制备Pd@Pt-Ru的过程及其在LFIA中对hCG的检测应用。

接着对所合成的三金属纳米酶进行基本表征，如下图2所示。合成的Pd@Pt-Ru纳米颗粒呈近似球形(图2a)，平均粒径约为48 nm(图2b)。图2c显示了单个Pd@Pt-Ru纳米颗粒的形态，从而揭示了许多分支。图2c的插图显示，这些分支具有约2 - 3 nm的近球形形态，而在球体表面上出现明显的条纹，间隔约0.23 nm（图2d）。利用能谱(EDS)线扫描分析Pd@Pt-Ru元素分布，发现存在Pd、Pt和Ru(图2e)。Pt呈现锯齿状，从而表明不均匀分布和裂缝的存在。在放大后的图像(图2f)中，Ru出现在最外层。这些发现表明Pd@Pt−Ru在内层、中间层和表层分别具有由Pd、Pt和Ru组成的夹层结构，这与元素分布图一致(图2h,i)。Pd、Pt和Ru的比例分别为58%、34%和7%(图2g)。

图2. Pd@Pt-Ru纳米酶的结构和组成分析。(a) TEM图像，(b)粒度分布，(c)高分辨率透射电镜图像，(d)表面分支端面间距，(e,f)线扫描EDS谱，(g)组成，(h)扫描透射电镜(STEM)图像，(i) Pd@Pt−Ru纳米酶元素分布。

纳米酶的过氧化物酶样活性归因于活性氧的产生，特别是羟基自由基(•OH)因此，利用对苯二甲酸(TA)在催化过程中检测•OH。Pd@Pt-Ru基团的荧光最强烈，其次是Pd@Pt基团，而Pd@Pt-Au基团的荧光相对较弱(图3a)，这表明Pd@Pt-Ru在催化过程中产生了更高浓度的•OH。如图3b所示，不同基团产生的•OH浓度依次为Pd@Pt-Ru>Pd@Pt>Pd@Pt-Au。荧光强度和ESR光谱显示Pd@Pt-Ru产生的•OH浓度明显高于Pd@Pt和Pd@Pt-Au，从而证实了Pd@Pt-Ru具有优异的过氧化物酶样活性。在催化过程中，纳米酶表面的H₂O₂分解可能是一个限速步骤。为了进一步了解Pd@Pt-Ru的过氧化物酶样活性，我们采用密度泛函理论分析了潜在的H₂O₂催化作用。在这三种模型中，H₂O₂最初都吸附在表面(图3c)。其中Pd@Pt-Ru(111)的H₂O₂吸附能最低(图3d)。

图3. (a) Pd@Pt、Pd@Pt-Au和Pd@Pt-Ru的电子自旋共振(ESR)谱;(b)以对苯二甲酸(TA)为荧光探针，Pd@Pt、Pd@Pt-Au和Pd@Pt-Ru对羟基自由基形成的影响;(c) H₂O₂在纳米酶表面的裂解;(d) (c)中对应模型的相对能量。

接下来以hCG为分析物，探究了不同纳米酶在LIFA中应用性能的比较。对于基于AuNP的侧流免疫分析法(AuNP-LFIA)， hCG的视觉检出限(LOD)在25 IU/L下确定，如图4a所示。相比之下，Pd@Pt-Ru修饰的LFIA的LOD更高，为6.4 IU/L(图4b)，用TMB-H₂O₂ (A-Pd@Pt-Ru-LFIA)进一步扩增，LOD提高到0.1 IU/L(图4c)。在C线和T线处，使用ImageJ软件计算相应的灰度值，如图4d-f所示。显然，hCG浓度的增加与T线灰度值的增加有关，而C线灰度值保持相对稳定。将T线上的灰度值与hCG浓度关联，AuNP-LFIA和Pd@Pt-Ru-LFIA分别得到y = 0.00061x + 0.015和0.0073log(x) + 0.017线性方程(图4g和5h);使用TMB-H₂O₂进行信号放大后，曲线变为y = 0.092log(x) + 0.12(图4i)，经计算LOD分别为20、1.3和0.071 IU/L。

图4. LFIAs检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)。(a) AuNP-LFIA和(b) Pd@Pt-Ru-LFIA;(c) Pd@Pt-Ru-LFIA, H₂O₂-TMB信号放大(H₂O₂和TMB浓度分别为2 M和62.5 mM);(d) AuNP-LFIA、(e) Pd@Pt-Ru-LFIA、(f) Pd@Pt-Ru-LFIA经信号放大后检测hCG的灰度值;(g) AuNP-LFIA、(h) Pd@Pt-Ru-LFIA、(i) Pd@Pt-Ru-LFIA检测hCG的信号放大线性曲线。

此外，作者还评估了A-Pd@Pt-Ru-LFIA对不同抗原的反应。图5a、d显示，与牛血清白蛋白(10mg /mL)、促卵泡激素(6.5 IU/L)、黄体生成素(6.5 IU/L)、促甲状腺激素(1 mIU/L)、人血清白蛋白(10mg /mL)和人免疫球蛋白(5mg /mL)相比，A-Pd@Pt-Ru-LFIA对hCG具有选择性。在连续7次hCG检测(6.4 IU/L)后，灰度值保持相对稳定(图5b,e)，相对标准偏差为6.94%，从而证实了A-Pd@Pt-Ru-LFIA具有良好的精度。即使在37°C下保存11天，试纸条仍能保持令人满意的稳定性来检测hCG(图5c,f)。此外，峰值回收率在94%~103%范围内进行，这表明A-Pd@Pt-Ru-LFIA检测hCG的准确性良好(图5g)。酶联免疫吸附法被认为是检测hCG的金标准。因此，比较ELISA和Pd@Pt-Ru-LFIA检测不同hCG浓度(图5h)。拟合常数为0.99，表明建立的A-Pd@Pt-Ru-LFIA可用于临床样品中hCG的检测。最后，采用A-Pd@Pt-Ru-LFIA对华南大学第二附属医院15例临床样本进行hCG检测。阳性检出率和阴性检出率均达到100%(图5i)，具有良好的检测灵敏度和特异性，具有良好的实际应用前景。

图5. A-Pd@Pt-Ru-LFIA检测性能评价。(a,d) A-Pd@Pt-Ru-LFIA检测的选择性，(b,e)精密度，(c,f)稳定性，(g)准确度。(h)酶联免疫吸附法(ELISA)与A-Pd@Pt-Ru-LFIA检测hCG的比较;(i) A-Pd@Pt-Ru-LFIA检测的临床应用。

总结：

1. 合成了Pd@Pt, Pd@Pt-Au和Pd@Pt-Ru纳米酶，Ru引起电子从Pd@Pt向Ru的迁移，而Au则逆转了电子的迁移。

2. 与Pd@Pt和Pd@Pt-Au表面相比，H₂O₂在Pd@Pt-Ru表面的裂解能量更低。这种增强的过氧化物酶样活性有助于利用Pd@Pt-Ru增强基于LFIA的hCG检测，从而实现低至0.1 IU/L的可见LOD，比使用AuNP-LFIA高250倍。

3. A-Pd@Pt-Ru-LFIA在临床样品中检测hCG的真阳性和阴性率达到100%，显示出显著的临床应用潜力。

参考文献：

Wang, Weiguo, et al. "Palladium/Platinum/Ruthenium Trimetallic Dendritic Nanozymes Exhibiting Enhanced Peroxidase-like Activity for Signal Amplification of Lateral Flow Immunoassays." Nano Letters (2024).