一种基于温和噬菌体的用于食品基质中金黄色葡萄球菌的快速灵敏检测的纳米酶比色法

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是一种重要的食源性病原体，它能产生多种毒素，如金黄色葡萄球菌肠毒素，并引发严重的金黄色葡萄球菌食物中毒，其症状包括呕吐和腹泻。此外，许多SE基因可以通过移动遗传元件的水平基因转移在金黄色葡萄球菌种群中传播，如前噬菌体、质粒、金黄色葡萄球菌致病岛（Staphylococcus aureus pathogenicity islands, SaPIs）和携带肠毒素基因簇（enterotoxin gene cluster, egc）的基因岛。为了确保食品安全并减少细菌威胁的风险，必须对食品样品进行选择性检测以筛查活的金黄色葡萄球菌。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法包括聚合酶链反应、点杂交、侧流技术或基于纳米材料的酶联免疫吸附测定。然而，这些技术通常成本高昂，需要复杂的实验室条件，并且样品制备过程相对复杂。纳米材料在开发高效检测方法方面具有广阔的前景。金属有机框架（metalorganic frameworks, MOFs）具有高度有序的晶体结构和多孔结构，并且比表面积大，使其成为生物和化学传感器的理想材料。利用Cu-MOF的独特光学特性进行比色检测是一种简单、经济且快速的选择。比色法的优势在于可以进行视觉监测，不需要复杂的仪器或设备。然而，这些方法中没有一种能够区分活的和死的细菌细胞。因此，食品应用中需要能以低成本、较高稳定性和高特异性检测活金黄色葡萄球菌的新型比色生物传感器。

与抗体、酶和核酸等其他固定识别元件相比，噬菌体具有多个优点，包括能耐高温和pH变化，且保质期长。它们只感染活的细菌细胞，且具有宿主特异性。噬菌体在生物传感应用中的关键特性是它们的感染性、与目标细菌细胞的特异性相互作用以及噬菌体引发的细胞裂解。裂解周期和溶原周期是噬菌体在细菌细胞内表现出的两种不同生命周期。温和噬菌体通常将其基因组整合到细菌染色体中，从而进入溶原生命周期。然而，使用温和噬菌体作为生物识别元件的噬菌体基生物传感器检测金黄色葡萄球菌的研究较为稀少。

近日，扬州大学食品科学与工程学院Guoqiang Zhu团队在International Journal of Food Microbiology期刊上发表了题为：Nanozyme colourimetry based on temperate bacteriophage for rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus in food matrices的论文。

为了解决该问题，本研究分离了三种温和性金黄色葡萄球菌噬菌体，并测量了其生物特性，包括单步生长、宿主范围、pH 稳定性、温度稳定性和吸附率。随后开发了一种基于温和性噬菌体SapYZUs8和Cu-MOF的纳米酶检测方法，该方法具有低成本、高特异性和高灵敏度，可用于检测活的金黄色葡萄球菌。

图1 噬菌体SapYZUs8颜色比色传感器合成路线，结合了纳米酶Cu-MOF，标记为“SapYZUs8@Cu-MOF”（浅紫色区域）。检测S. aureus的示意图使用了SapYZUs8@Cu-MOF（浅绿色区域）。

在该研究中，将处于对数生长期的细菌细胞用丝裂霉素C处理，经过5 h孵育后，从金黄色葡萄球菌菌株YZUsa35、YZUsa12和YZUsa43中分别诱导出三种温和性噬菌体（SapYZUs8、SapYZUm7和SapYZUs16）。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）分析显示，三种噬菌体均由长的不可收缩尾部（204–301 nm）组成（图2A–C）。然而，噬菌体SapYZUs8和SapYZUm7还含有延长的头部（47–78 nm），而噬菌体SapYZUs16则表现为等轴形态（44和52 nm）。主要基因型为ST9-t899（42.6%，20/47），其次是ST188-t189（4.3%，2/47）、ST1516-t1852（4.3%，2/47）、ST7579-t034（4.3%，2/47）和ST8848-t034（4.3%，2/47）。SapYZUs8在pH值为3-12时表现出良好的稳定性（稳定率>90%），在37°C下孵育2 h后，表现出良好的稳定性，而SapYZUm7和SapYZUs16则在pH值为3-11时稳定性较高（稳定率>60%）（图2D）。SapYZUs8噬菌体在40–60°C孵育20、40或60 min后仍表现出良好的稳定性（图2E）。然而，SapYZUm7和SapYZUs16噬菌体仅在40-50°C孵育时保持稳定性。此外，SapYZUs8的吸附率在8 min时达到91.1%（图2F），与SapYZUm7（10 min，71.1%）和SapYZUs16（10 min，62.6%）相比，表现良好。

图2 噬菌体SapYZUs8（A）、SapYZUm7（B）和SapYZUs16（C）的TEM图像。SapYZUs8、SapYZUm7和SapYZUs16的pH稳定性（D）、热稳定性（E）和吸附率（F）。虚线包围的区域表示模板噬菌体SapYZUs8、SapYZUm7和SapYZUs16分别通过放线菌素C诱导的S. aureus菌株YZUsa35、YZUsa12和YZUsa43。显著性水平设定为 p < 0.05 (*) 或 p < 0.001 (**)。

优化检测条件后，研究人员研究了SapYZUs8@Cu-MOF显色系统对金黄色葡萄球菌的检测行为。随着不同浓度的金黄色葡萄球菌加入，SapYZUs8@Cu-MOF显色系统在652 nm处的吸光度显著降低（图3A）。如图3B所示，显色系统在652 nm处的吸光度与金黄色葡萄球菌的浓度呈线性关系，表示为A = − 0.063 log(C_{S. aureus}) + 0.76。此外，检测限（limit of detection, LOD）低至1.09 × 10² CFU/mL。

该研究选择了11种细菌菌株作为可能的共存干扰物。如图3C所示，使用SapYZUs8@Cu-MOF显色系统选择性检测了金黄色葡萄球菌宿主。此外，还测试了SapYZUs8@Cu-MOF显色系统对干扰物的敏感性。如图3D所示，上述细菌并未干扰金黄色葡萄球菌的比色检测。这些结果表明，SapYZUs8@Cu-MOF显色系统在检测金黄色葡萄球菌方面具有令人满意的选择性。

图3 (A) SapYZUs8@Cu-MOF + H₂O₂ + TMB显色系统在10¹–10⁸菌落计数下的颜色变化和紫外-可见光谱图，(B) 拟议方法的标准曲线。(C) 使用SapYZUs8@Cu-MOF显色系统检测S. aureus YZUsa1和11种细菌菌株。(D) 使用SapYZUs8@Cu-MOF显色系统检测S. aureus YZUsa1和S. aureus YZUsa1与十一种病原体混合物。

为了进一步评估SapYZUs8@Cu-MOF显色系统的检测性能，在实际食品样品（脱脂牛奶和猪肉汁）中进行了金黄色葡萄球菌的比色检测。如图所示，获得的回收率在92.4%到108.6%之间，结果与传统方法一致。

图4 SapYZUs8@Cu-MOF对真实食品中金黄色葡萄球菌检测的检测性能。显著性水平为p < 0.05(*)。

综上所述，本研究报道了一种基于温和性噬菌体SapYZUs8的纳米酶比色策略的开发与优化，该策略能够高特异性和准确性地检测金黄色葡萄球菌。SapYZUs8成功固定在Cu-MOF上，整个SapYZUs8@Cu-MOF显色系统的检测时间小于30 min，检测限低至1.09 × 10² CFU/mL。此外，SapYZUs8@Cu-MOF在食品样品中成功用于金黄色葡萄球菌的比色检测，不受食品添加剂、NaCl浓度或pH值的干扰。因此，该方法灵敏、准确、简单、快速、特异且成本低廉，适用于现场筛查，并能防止各种食品中活性金黄色葡萄球菌的污染。

论文来源：https://doi.org/10.1016/i.ijfoodmicro.2024.110657