一种基于CRISPR/Cas13a辅助化学发光共振能量转移的金黄色葡萄球菌灵敏且现场检测方法

近年来，由致病细菌引发的食品安全事件频发，全球对此的关注日益增加。作为一种常见的革兰氏阳性病原菌，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是四种常见的食源性病原体之一，它们可以引起食物中毒和传染性疾病。因此，对食品中S. aureus污染的快速筛查和检测对于准确追踪和有效控制至关重要，最终有助于确保食品安全并降低食源性疾病和感染的风险。传统的致病菌检测方法，如微生物培养和聚合酶链式反应，由于其操作复杂、耗时、灵敏度和特异性低等限制，应用受限。近年来，基于各种识别元素（抗体、适配体、抗生素、凝集素和噬菌体等）的传感器已被广泛研究，用于便捷且特异地检测致病菌。然而，这些策略中有些存在灵敏度低、操作复杂、需要大型仪器和成本高等缺点。

近年来，距离依赖的化学发光共振能量转移现象（chemiluminescence resonance energy transfer phenomenon, CRET）得到了深入研究，用于设计不需要外部光源且不易发生光漂白的传感器，从而实现高灵敏度检测。最近，基于CRISPR/Cas系统（包括Cas9、Cas12和Cas13）的传感器因其强大的特异性和简单的操作性，被广泛设计用于检测各种分析物（如细菌、病毒、小分子、金属离子等）。CRISPR/Cas13a系统由Cas13a蛋白和CRISPR RNA（crRNA）组成，利用crRNA指导的Cas13a核酸酶（Cas13a/crRNA）进行RNA靶向，并通过激活转切割效应来降解数千个非特异性RNA。为了进一步提高检测的灵敏度和便捷性，免疫层析试纸条（immunochromatographic test strip, ICTS）作为一种最具可行性的现场检测方法，已被广泛应用于食品安全控制、疾病筛查和环境监测领域。

近日，中国西南大学药学院Erqun Song团队在Analytical Chemistry期刊上发表了题为：Sensitive and on-Site Detection of Staphylococcus aureus Based on CRISPR/Cas 13a-Assisted Chemiluminescence Resonance Energy Transfer的论文。

为了解决这些问题，该研究设计了一种基于CRISPR/Cas13a辅助的CRET策略，以利用鲁米诺和金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）分别作为供体和受体，实现对S. aureus的灵敏且特异的检测。

该研究基本原理如图1所示。S. aureus一旦被aptamer S. aureus-cRNA杂交双链识别，cRNA就会被释放并与CRISPR/Cas13a结合，从而启动CRISPR/Cas13a系统对AuNPs-RNA1-HRP中RNA1的转切割，导致HRP从AuNPs上分离。如图1A所示，当引入化学发光底物H₂O₂和鲁米诺后，含有S. aureus的检测样品的化学发光信号由于CRET“关闭”而显著增强，与不含S. aureus的样品相比表现出更强的信号。此外，设计了一种ICTS，并将其与CRISPR/Cas13a辅助的CRET策略集成，以实现在现场对S. aureus的便携式检测（图1B）。在S. aureus存在的情况下，CRISPR/Cas13a被激活以转切割AuNPs-RNA1-HRP，随后只有RNA1-HRP的切割片段被捕获在试纸条T线上的抗HRP抗体，从而由于CRET“关闭”在加入H₂O₂和鲁米诺底物后产生强烈的化学发光信号。在没有S. aureus的情况下，整个AuNPs-RNA1-HRP探针将被T线上涂有抗HRP抗体捕获，此时，由于化学发光供体和AuNPs能量受体之间的CRET“开启”，观测到的是被抑制的化学发光信号。同时，预涂有HRP的C线作为阳性对照线，通过显示恒定的化学发光信号来验证实验的正常进行。ICTS的化学发光信号可以直接通过智能手机成像，而不需要昂贵的仪器，使得该检测方法（ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET）非常适合现场分析。

图1 (A) CRISPR/ Cas13a辅助的CRET和(B)基于icts的ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET检测S. aureus示意图。

其次，研究人员对AuNPs-RNA1-HRP进行了表征。如图2A所示，与未与RNA1共存的AuNPs溶液在经历冷冻和解冻后出现聚集现象相比，与RNA1共存的AuNPs溶液仍然保持清澈透明，并保留原有颜色，表明AuNPs与RNA1共存具有良好的稳定性，间接证明了AuNPs-RNA1复合物的成功构建。此外，如图2B、2C所示，引入RNA导致了ζ电位的负移和AuNPs水合直径的明显增加，这归因于核酸的带负电性质，进一步确认了AuNPs-RNA1的成功制备。根据已发表的研究，修饰有核酸的AuNPs在高盐溶液中表现出较高的耐盐性。如图2D所示，即使在300 mM NaCl高盐溶液中处理，AuNPs-RNA1仍表现出良好的单分散性，而裸AuNPs则出现了明显的聚集现象，这表明AuNPs-RNA1复合物具有良好的稳定性。随后，通过Eppendorf Biophotometer D30对AuNPs-RNA1上的RNA1含量进行了定量，结果显示，AuNPs（1 nM）上RNA1的浓度约为56 nM。接着，将AuNPs-RNA1与链霉亲和素-HRP孵育，制备AuNPs-RNA1-HRP，其ζ电位值显示出轻微变化，这可能是由于HRP的等电点范围较宽。如图2C所示，AuNPs-RNA1-HRP的水合直径明显大于AuNPs-RNA1，且仅AuNPs-RNA1-HRP与TMB反应组（图2E中的蓝色线）显示出约650 nm的TMB氧化物特征吸收峰，表明成功制备了AuNPs-RNA1-HRP探针。

图2 (A) AuNPs及AuNPs + RNA1混合物在冷冻和解冻后的紫外-可见吸收光谱及其数字照片；(B) AuNPs、AuNPs-RNA1和AuNPs-RNA1-HRP的ζ电位；(C) AuNPs、AuNPs-RNA1和AuNPs-RNA1-HRP的水合粒径；(D) 未经或经过NaCl处理的AuNPs和AuNPs-RNA1的吸收光谱及其数字照片；(E) 添加或未添加TMB溶液的AuNPs-RNA1-HRP和AuNPs-RNA1的紫外-可见吸收光谱。

优化了检测条件后，使用CRISPR/Cas13a辅助CRET方法进行S. aureus的定量检测。如图3A所示，相对化学发光强度（ΔI/I0）与S. aureus浓度的对数值在10至10⁵ cfu/mL范围内呈线性关系，检测限为7 cfu/mL【ΔI/I₀ = 0.1667Log10N_{S. aureus} + 0.7567，R² = 0.9915，N代表S. aureus的数量（cfu/mL）】。检测限通过以下公式确定：LOD = 3S/K，其中S为空白样品的标准偏差（n = 10），K为校准曲线的斜率。

在自然环境中，S. aureus通常与其他细菌共存。因此，通过测量检测系统中含有S. aureus和其他干扰细菌的样品的ΔI/I0值，评估CRISPR/Cas13a辅助CRET检测S. aureus的选择性。如图3B所示，从三个单独的干扰细菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌）以及三种干扰细菌混合物（标记为混合物1）中获得的ΔI/I0值显著低于S. aureus样品（10⁵ cfu/mL）获得的ΔI/I0值。然而，S. aureus样品和与上述干扰细菌混合物（标记为混合物2）获得的ΔI/I0值几乎相同，这表明所提出的CRISPR/Cas13a辅助CRET策略在检测S. aureus时表现出良好的选择性。

图3 (A) ΔI/I₀值与其对数浓度之间的校准曲线；(B) 含有金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）及其混合物的样品的相对化学发光强度。混合物1包含大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和铜绿假单胞菌；混合物2包含大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

为证明ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET在实际样品中检测金黄色葡萄球菌的适用性，采用饮用水和牛奶分别加入不同浓度的金黄色葡萄球菌（0、10、10²、10³、10⁴和10⁵ cfu/mL）作为模型进行分析。如图4C、D所示，T线的化学发光信号随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增强，在饮用水和牛奶中最低可检测到10² cfu/mL的金黄色葡萄球菌。与明场结果相比，基于所提出的ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET的化学发光模式检测金黄色葡萄球菌的LOD比明场下的比色模式降低了10倍，从而显示出更高的现场检测灵敏度。ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET策略在食品中检测金黄色葡萄球菌的LOD值比报道的方法低10-100倍，虽然前者检测时间约为2 h，比后者长。但对于现场检测来说，2 h的检测时间是可以接受的。

图4 (A) 基于ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET检测方法的特异性测试（a、b、c和d分别代表空白、金黄色葡萄球菌S. aureus、大肠杆菌E. coli和单核细胞增生李斯特菌L. monocytogenes）；(B) T线条带灰度值的统计图；(C)饮用水和(D)牛奶中使用ICTS-CRISPR/Cas13a-CRET检测金黄色葡萄球菌S. aureus的结果。

综上所述，本研究展示了一种基于CRISPR/Cas13a辅助的化学发光共振能量转移（chemiluminescence resonance energy transfer phenomenon, CRET）策略，用于金黄色葡萄球菌的特异性、简单且灵敏的检测。通过将CRISPR/Cas13a辅助的CRET策略与免疫层析试纸条（immunochromatographic test strip, ICTS）相结合，实现了在饮用水和牛奶中低至10² cfu/mL的金黄色葡萄球菌的现场便捷检测，仅需使用智能手机。这种检测方法相比其他已报道的基于ICTS的策略，灵敏度提高了至少10倍，显示出在食品样品中进行金黄色葡萄球菌现场检测的巨大潜力。此外，本研究成功开发了一个通用平台，通过更换相应的识别适配体，可以检测各种目标致病菌。

论文来源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c01782