快速且经济的厌氧细菌检测

厌氧细菌（Anaerobic bacteria）是人类宿主正常微生物群的重要组成部分。大多数体表和粘膜上都有厌氧菌。为了最佳地回收厌氧菌，必须遵循适当的收集、运输和处理程序。处理原代培养板（Primary culture plates）是为了从原始标本中分离出重要的厌氧生物进行鉴定。需要注意的是厌氧培养基允许兼性厌氧细菌生长。所有分离的细菌必须经过空气耐受性试验（Aerotolerance testing）。在检查过程中，必须采取特别的预防措施，避免将培养板暴露在氧气中。即使暴露10分钟也会杀死一些对氧敏感的细菌(梭杆菌Fusobacterium spp.、卟啉单胞菌Porphyromonas spp.和厌氧球菌)。快速圆盘试验（Rapid disk）、spot tests等方法为厌氧菌的鉴定构建了成本低廉且有效的系统。其中许多测试的成本都不到0.5美元。例如，吲哚试验（Spot indole Test，某些生物从色氨酸中分离吲哚），硝酸盐圆盘还原试验（Nitrate disk reduction Test， 硝酸盐可以被具有硝酸还原酶的生物还原为亚硝酸盐和其他还原产物，可用于从梭杆菌中分离解尿杆菌）。胆汁试验（Bile test，有些生物能在胆汁中生长），以及一些厌氧生物在紫外线照射下能发出荧光。厌氧菌的快速鉴定可以用商业上可用的微系统来完成，这些微系统可以在几小时内检测到预形成的酶，从而消除了对分离菌生长的需要。这些系统中，每个数据库中所包含的生物的数量和类型以及用于分化的底物都存在差异。有些使用荧光底物，有些使用显色底物。大多数在孵育后需要添加一些试剂。有研究发现，将RapID ANA panel与传统的预还原厌氧灭菌生化试剂进行比较，结果表明259个新鲜临床分离株中有94%的属鉴定正确，87%的鉴定与物种水平一致。BBL Crystal ANR ID系统对322个具有临床意义的厌氧菌进行了评估，发现在初始测试时与常规鉴定的一致性为82%，重复测试后达到89%。这类系统使用方便，不需要添加试剂，而且比传统的生化系统提供了更快的周转时间。Vitek ANI Card与传统方法检测脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的相关性为100%。补充检测可提高准确性。A new card (ANC)与Vitek 2结合可鉴定厌氧菌和棒状杆菌，它的数据库有63个厌氧菌和棒状杆菌分类群，并使用含有显色底物的比色技术。在加拿大和美国的三家三级保健医院使用ANC得出的结论是，卡片的厌氧部分对其数据库中包含的分离株表现良好，识别临床分离株可达95%的正确率。使用这些系统，可以实现快速识别，系统不需要细菌生长，对挑剔的厌氧生物有益，不依赖于糖分解活性。许多分离株可以被鉴定，而无需花费预还原厌氧灭菌的生化试剂。快速酶促测试系统的局限性包括:1)与其他常规信息(如革兰氏染色、群体形态和生物体生长需求)结合使用。2)对产生的颜色进行分析可能很困难，但对于获得准确的可重复结果至关重要。识别系统受其数据库的限制，不能及时或自动地包括最近的分类变化。4)相对惰性的生物可能被错误识别，具体的培养基要求因生产厂家而异，最近没有传代培养的生物体可能会表现出异常的结果。鉴定厌氧菌的生化系统依赖于分离生物生长过程中底物的代谢分解和最终产物的产生。当需要进行物种鉴定时，至少有两种商业试剂盒系统适合，用于临床微生物学实验室中通常分离的厌氧菌的鉴定:API 20A （bioMe rieux, Inc.）和AN微孔板（Biolog）。两者都依赖于过夜孵化。用于分析的理想标本是在brucella BAP或其他适合生长厌氧菌的培养基上培养24至48小时的菌落。16S rRNA也被越来越多地用于厌氧菌的分子鉴定。对比这种方法与生化方法对重要血液分离物的鉴定，发现PCR是一种更准确的鉴定手段。在316株分离物中，16S rRNA对属水平和种水平的识别率分别为100%和91%，而常规方法对属水平和种水平的识别率分别为88%和66%。目前，分子方法仅限于有能力利用测序进行常规鉴定的实验室。为了使分子方法成为厌氧鉴定的标准，除了更好的可用性之外，还需要更好的指导来解释测序结果，并且可能仍然存在无法仅通过16S rRNA基因测序确定的分离株。另外，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定厌氧菌可得到更多数据。

Figure 1. RapID™ ANA II System （www.thermofisher.cn）

参考文献：Leber, A. L. (2020). Clinical microbiology procedures handbook. John Wiley & Sons.