基于Au-Fe3O4哑铃状纳米颗粒的横向流动免疫分析法用于比色和光热双模检测SARS-CoV-2刺突蛋白

横向流动免疫分析（Lateralflowimmunoassay，LFIA）是一种基于纸张的检测和定量分析平台，结果在5-30分钟内显示出来。LFIA因其检测速度快、易于操作和成本低而引起了广泛的兴趣。在住宅、医院和临床实验室中，基于LFIA的检测通常用于对特定抗原和抗体以及基因扩增产物进行定性和定量检测。因此，LFIA技术已成为一种非常有前景的快速检测SARS-CoV-2抗原（如刺突糖蛋白（spikeglycoprotein，Sprotein）），确认病毒感染的。然而，传统LFIA在灵敏度和定量检测方面的局限性，使得它不仅难以用于早期疾病诊断，而且难以进行广泛的筛查。标签材料被认为是影响LFIA性能的重要因素。目前常用的胶体金标记存在灵敏度低、定量困难等问题，严重阻碍了LFIA的进一步应用。

基于此，中国石油大学的研究者开发出一种基于新型哑铃型金-四氧化三铁异二聚体纳米颗粒（Au-Fe₃O₄NPs）的双模检测平台应用于SARS-CoV-2病毒的检测中，如图1a所示，Au-Fe₃O₄被HS-（PEG）n-COOH功能化，并与S蛋白检测抗体偶联得到免疫颗粒（INPs）。双模试纸条的基本设计和操作如图1b所示。该平台巧妙地利用了Au-Fe₃O₄NPs独特的结构和光学特性：哑铃型Au-Fe₃O₄NPs相比传统球形纳米颗粒具有更大的比表面积和更强的LSPR效应，赋予其优异的比色性能，可用于LFIA的目视定性检测。Au-Fe₃O₄NPs的异质结构促进了光能向热能的转化，产生显著的光热效应。通过近红外激光激发和热成像分析，可实现对病毒抗原的定量检测。具体而言，研究人员将Au-Fe₃O₄NPs与针对SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）的抗体偶联，制备成免疫探针。在LFIA平台上，该探针可与目标S蛋白特异性结合，形成肉眼可见的彩色条带，实现对病毒的快速定性检测。同时，通过测量条带区域的温度变化，可进一步实现对S蛋白的定量分析。

图1检测原理图

透射电子显微镜（TEM）图像显示，合成的Au-Fe₃O₄纳米颗粒呈现出均一的哑铃状结构，平均尺寸为31±1.42 nm，并呈现出酒红色溶液的特征颜色。元素分析进一步证实了这种独特的哑铃形貌。抗体修饰后，纳米颗粒尺寸略有增大，但荧光标记实验证实抗体成功偶联到Au-Fe₃O₄NPs表面，形成免疫纳米颗粒（INPs）。光学性质研究表明，Au-Fe₃O₄NPs在520 nm处表现出最大紫外吸收峰，与金纳米颗粒的典型吸收峰相符。抗体修饰后，吸收峰略微红移，表明抗体偶联对纳米颗粒的光学性质影响很小。光热性能测试显示，Au-Fe₃O₄NPs表现出比单独的金纳米颗粒或四氧化铁纳米颗粒更强的光热效应，这得益于其异质结构。进一步研究表明，31 nm的哑铃形Au-Fe₃O₄NPs具有最高的光热转换效率（22.44%），优于其他尺寸的纳米颗粒。

图2.Au-Fe₃O₄NPs的表征。（a，b）透射电镜图像中NPs的形态学特征。插入物为Au-Fe₃O₄NPs溶液。（c）Au-Fe₃O₄NPs的尺寸分布。（d）Au、Fe、O的EDX元素映射及其叠加。（e）Au-Fe₃O₄NPs和INPs的紫外可见光谱。（f）不同纳米材料在808nm红外光照射下的温度

为优化双模LFIA检测性能，研究人员系统地评估了光热激发功率、激发时间、纳米颗粒浓度等关键参数，确定了最佳检测条件。在优化条件下，该方法对S蛋白的检测限低至1.22pg/mL，线性范围为10²~10⁶ pg/mL，灵敏度优于多数现有LFIA方法。除了提供可视化定性结果外，该方法还可通过测量温度变化实现S蛋白的定量检测。相比之下，该方法简化了材料合成和检测步骤，兼具高灵敏度和易操作性，在S蛋白检测方面展现出巨大应用潜力。

图3.（a）各种sars-cov-2s蛋白浓度的试纸图像（眼睛代表目视观察的检测限）。（b）不同量的sars-cov-2s蛋白测试条的热红外图像。（c）浓度在10² pg/mL至10⁶ pg/mL范围内的SARS-CoV-2检测线性响应。用三个实验计算了误差条。

该双模LFIA平台对SARS-CoV-2S蛋白表现出优异的特异性，即使在其他常见呼吸道病毒浓度高出5倍的情况下也不产生干扰信号。此外，该方法稳定性良好，储存8周后性能保持一致。实验结果显示，组内和组间变异系数分别为6.6%和9.64%，表明该方法具有良好的重复性和可靠性，适用于S蛋白的准确检测。

图4.（A）GPD-可视化检测3CL蛋白酶的示意图；（B）用不同浓度的3CL蛋白酶处理1nMGPD-3CL2小时，然后加入0.6MNaCl的照片。

图5.（a）双模LFIA检测sars-cov-2s伪病毒的性能分析。（b）胶体金试纸条对sars-cov-2s伪病毒的检测结果。

研究人员使用灭活的SARS-CoV-2假病毒验证了该双模LFIA平台的实际应用效果。结果显示，该方法能够灵敏地检测出低至10⁴ copies/mL的假病毒，相比之下，传统胶体金试纸条的检测限为10⁶ copies/mL，灵敏度提升了两个数量级。这表明该基于Au-Fe₃O₄NPs的双模LFIA平台在SARS-CoV-2抗原检测方面具有更高的灵敏度和应用潜力。

本研究成功构建了一种基于Au-Fe₃O₄哑铃状纳米颗粒的比色-光热双模LFIA平台，用于SARS-CoV-2S蛋白的快速灵敏检测。Au-Fe₃O₄异质二聚体结合了AuNPs和Fe₃O₄NPs的优异光热特性，实现了信号放大，显著提高了检测灵敏度。该平台不仅操作简便、成本低廉，而且特异性强、稳定性好，对S蛋白的检测限低至1.22pg/mL，比传统胶体金试纸条灵敏度提高了3个数量级。此外，该平台还能对假病毒样品进行有效检测，展现出良好的实际应用潜力。未来，可进一步探索利用Fe₃O₄的磁性进行样品富集和纯化，以进一步提升平台的检测灵敏度，拓展其在更多疾病标志物检测中的应用。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cclet.2023.109198