从微小分子到生态重建,CRISPR/Cas12a助力应对环境毒素威胁

引言

伏马菌素(FB)是一类由赤霉菌产生的霉菌毒素,是广泛存在于玉米、燕麦及相关产品中的一种有害物质。其中伏马菌素B1(FB1)是最常见和广泛分布的一种,被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。FB1与马脑白质软化和猪肺水肿等疾病有关,并可引起癌症和生殖毒性,因此准确、灵敏地检测FB1至关重要。

现有的检测方法主要依赖于高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、气相色谱-质谱联用(GC-MS/MS)和薄层色谱(TLC)等技术。然而这些方法通常需要复杂的仪器设备和繁琐的操作流程,限制了其在实际应用中的推广。2010年,McKeague报道了一种特异性结合FB1的核酶分子,为基于核酶的生物传感器检测FB1提供了新的可能。与传统方法相比,这种基于核酶的检测具有选择性高、亲和力强、操作简单等优势。

然而,单一的信号生成策略已无法满足对高灵敏检测的需求。近年来,研究者们开始将序列无关的外切酶引入到生物传感器的设计中,以实现信号的放大和增强。例如,Guo等人开发了基于氧化石墨烯和核酶触发信号放大的FB1生物传感器,检出限达到0.15 ng/mL。尽管在FB1检测领域做出了诸多努力,但实现高灵敏检测仍是当前面临的主要挑战,需要探索更加高效的信号放大策略。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一种源自细菌和古细菌对病毒侵染的适应性免疫系统,近年来被广泛应用于基因工程和分子诊断领域。其中CRISPR/Cas12a是一种RNA导向的DNA靶向系统,可以特异性识别并切割目标DNA序列,并且表现出非特异性切割单链DNA的活性。基于此,越来越多的研究者将CRISPR/Cas12a系统应用于构建各种荧光生物传感器。这类传感器的工作原理是,Cas12a识别并切割标记有荧光团和淬灭团的单链DNA,从而使其发出可测的荧光信号。然而,传统淬灭剂的淬灭效率有限,往往会导致较高的背景信号。

相比于其他2D纳米材料,δ-FeOOH纳米片具有特殊的优势,包括大比表面积便于固定探针DNA、室温铁磁性便于分离等。同时这种2D纳米材料自身优秀的荧光淬灭性能,可以有效降低CRISPR/Cas12a体系的背景噪声,提高其灵敏度。因此,将CRISPR/Cas12a与功能化的δ-FeOOH-NH₂纳米片相结合,有望构建出一种新型的高灵敏、高选择性的FB1生物传感器。

结果与讨论

1. δ-FeOOH-NH₂纳米片的表征

采用SEM、TEM、FT-IR、XRD等手段对合成的δ-FeOOH-NH₂纳米片进行了表征。结果显示,该纳米片呈现典型的二维片状结构,厚度在10-20 nm左右,横向尺度可达数百纳米。FT-IR光谱证实了氨基的成功引入,XRD图谱则显示其具有明显的结晶特征。DLS测试结果表明,修饰后的δ-FeOOH-NH₂纳米片在水溶液中呈现良好的分散性和稳定性。这些结构表征结果表明,成功地制备了具有优异性能的δ-FeOOH-NH₂纳米片。

2. CRISPR/Cas12a介导的δ-FeOOH-NH₂信号输出机制

为了构建基于CRISPR/Cas12a的FB1生物传感器,首先研究了该系统与δ-FeOOH-NH₂纳米片的信号放大机制。将荧光标记的单链DNA(ssDNA-FAM)固定在δ-FeOOH-NH₂纳米片表面,形成荧光报告探针。当Cas12a/crRNA复合物识别并切割ssDNA-FAM时,将导致其从纳米片表面脱离,从而恢复被淬灭的荧光信号。为进一步放大这一信号,引入了T7外切酶辅助的循环放大策略。T7外切酶可以选择性地从5'末端水解双链DNA,生成可激活Cas12a的DNA激活序列(aDNA)。aDNA与crRNA结合后,可以诱导Cas12a非特异性切割固定在δ-FeOOH-NH₂上的ssDNA-FAM,从而不断放大信号。值得注意的是,δ-FeOOH-NH₂纳米片优秀的磁性性能,可以方便地将切断后的荧光报告探针与淬灭剂分离,进一步降低背景信号,提高灵敏度。

3. FB1的检测性能

为了评估该生物传感器对FB1的检测性能,首先研究了FB1与其特异性核酶间的竞争性结合。当引入FB1时,其会与固定在磁珠上的核酶竞争性结合,导致原先与核酶杂交的单链DNA(S1)被释放。随后S1启动了T7外切酶介导的信号放大过程,产生aDNA激活Cas12a,从而切断固定在δ-FeOOH-NH₂上的ssDNA-FAM,恢复其荧光信号。通过调节FB1浓度，发现该传感器的检测范围从1 pg/mL扩展到100 ng/mL,检出限可达0.45 pg/mL,远优于以往报道的方法。为进一步验证该传感器的性能,作者采用原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)对其进行了分析。在引入FB1后,S1被释放,与S2形成双链DNA,表现为凝胶上较低分子量条带的增强;而在CRISPR/Cas12a系统作用下,固定在δ-FeOOH-NH₂上的ssDNA-FAM被切断,从而在凝胶上显示为荧光条带的减弱。这一结果进一步证实了本文报道的FB1检测机理。

结论

本文报告了一种基于CRISPR/Cas12a系统和2D δ-FeOOH-NH₂纳米片的新型荧光生物传感器,用于对环境毒素FB1进行高灵敏、高选择性检测。该传感器巧妙结合了核酶的特异性识别和T7外切酶-Cas12a信号放大机制,实现了FB1的超低检出限。同时,δ-FeOOH-NH₂纳米片优异的荧光淬灭和磁分离性能,进一步降低了背景信号,提高了整体检测灵敏度。这种创新的检测方法不仅为CRISPR/Cas12a在生物传感领域的应用开拓了新思路,还展现了广泛的实际应用前景。未来,可以进一步优化该平台,并探索其在其他重要目标物质检测中的潜力。

参考文献

Li, X.; Ma, Y.; He, M.; Tan, B.; Wang, G.; Zhu, G., A novel fluorescent aptasensor for sensitive and selective detection of environmental toxins fumonisin B1 based on enzyme-assisted dual recycling amplification and 2D δ-FeOOH-NH2 nanosheets. Biosens. Bioelectron. 2024, 253, 116183.