用于肠沙门氏菌双读出检测的自组装双功能纳米花CRISPR/Cas生物传感平台

引言

食品和水源中细菌病原体的快速检测对于公众健康安全具有重要意义。沙门氏菌是一种广泛存在于环境和食物中的人畜共患病原体,每年造成大约25%的食源性疾病病例。尽管传统的细菌培养和菌落计数是沙门氏菌检测的"金标准",但需要专业操作人员且过程耗时,在快速现场检测方面受到了一定局限。此外,聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)也被用于沙门氏菌的检测,但PCR容易出现假阳性或假阴性结果,ELISA需要使用昂贵的抗体,因此这些方法在实用性上也受到一定限制。因此,在简单易用的格式下实现对环境和食品中沙门氏菌的灵敏、快速检测仍然具有挑战性。

近年来,基于CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR相关蛋白)系统的生物传感技术在分析科学领域显示出巨大潜力,主要得益于其对核酸靶标的精确识别能力。CRISPR/Cas系统不仅可以实现对各种核酸靶标的精确识别,还可以完成感知信号的放大和转换。与其他实验室分析方法相比,CRISPR/Cas系统驱动的生物传感器具有准确性、灵活性、简单性、低成本和可移植性等诸多优势。基于这些优势,众多基于CRISPR/Cas的生物传感器已被开发用于病原细菌的快速准确检测,主要利用Cas12a/Cas13蛋白的卓越的无特异性切割活性。例如,Kasputis等人开发了一种基于氧化石墨烯的CRISPR/Cas12a生物传感器,可在人血清中检测沙门氏菌,检测限低至3×10³ cfu/mL,且对其他细菌具有很好的特异性。此外,Duan等人整合了链式杂交反应和低背景福斯特共振能量转移信号输出模式,开发了一种改进的CRISPR/Cas12a生物传感器,用于在牛奶和鸡肉样品中检测沙门氏菌金霉菌,分别具有3.72×10² cfu/mL和8.71×10² cfu/mL的荧光定量灵敏度。目前,大多数基于CRISPR/Cas的病原体检测传感器依赖于单色荧光输出信号。尽管荧光测量提供了高灵敏度和成本效益,但易受环境因素、缓冲液组成变化和仪器波动的影响,可能导致错误的阳性或阴性结果。相比之下,基于CRISPR/Cas的比色生物传感器有望实现对病原体的直观灵敏检测,由于其可视性和简单操作。然而,CRISPR/Cas基比色生物传感器在针对病原体检测的灵敏度、选择性和多信号输出方面仍有待进一步提高。此外,将CRISPR/Cas介导的比色生物传感器转化为现场检测(POCT)工具也面临着巨大挑战。

最近,诸如重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)等各种核酸扩增技术已被应用于为高效激活CRISPR/Cas系统放大靶标信号。LAMP和RPA技术能在温和条件下扩增目标核酸,因此满足POCT的需求。除了广泛使用的等温扩增技术,酶介导的信号放大策略也是一种提高比色生物传感器分析性能(如灵敏度、实用性、相容性和适用性)的策略。例如,Samanta等人开发了一种结合CRISPR/Cas12a系统和叶绿素过氧化物酶(HRP)的新型双重放大检测策略,实现了对目标核酸的快速准确检测,检出限可达~10 fM。但是,天然酶(如HRP)通常存在催化条件苛刻、化学/物理稳定性低、催化活性有限和成本高昂等固有缺点。人工酶或具有生物酶活性的纳米材料(即纳米酶)已成为天然酶的潜在替代品和强有力竞争者,其表现出可调的催化活性、制备简单、成本低和环境耐受性等优异性能。重要的是,纳米酶表现出杰出的催化活性和出色的溶剂稳定性,可以有效地提高比色检测的可靠性。因此,将CRISPR/Cas系统对核酸的精确识别与纳米酶介导的信号放大相结合,可为构建灵敏、可靠和稳定的生物传感平台提供有前景的策略。

本研究通过自组装策略,利用铜离子(Cu²⁺)作为无机组分,并使用血红素(也称为铁原卟啉IX,一种著名的金属卟啉)和绒毛膜促性腺激素(hCG)蛋白作为有机组分,成功制备了具有hCG-血红素双功能性的纳米花纳米酶(BFNzyme)。所制备的纳米花表现出卓越的过氧化物酶(POD)样活性,能够高效地催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在H₂O₂存在下氧化为蓝色的氧化TMB(TMBox)。此外,纳米花中含有的hCG可以被妊娠试纸条高效识别。受制备BFNzyme出色性能的启发,我们构建了一种基于LAMP扩增、CRISPR/Cas12a介导的核酸切割能力和BFNzyme介导的信号放大策略的双信号输出沙门氏菌检测平台。在这种双信号输出的CRISPR/Cas12a生物传感策略中,BFNzyme作为一种双功能信号探针,通过单链DNA(ssDNA)预先标记磁珠(MBs)。此外,LAMP用于放大目标核酸。另外,Cas12a蛋白与向导RNA(gRNA)预先形成核糖核蛋白复合物。在目标存在的情况下,Cas12a的无特异性切割活性被激活,从而切割ssDNA连接子,导致BFNzyme释放到溶液中。得益于其双功能性质,该纳米酶不仅可用作信号放大标签实现灵敏的比色信号输出,而且通过结合妊娠试纸条也能实现LFA信号输出。此外,建立的双信号输出CRISPR/Cas12a生物传感器在实际样品中对沙门氏菌的检测表现出高灵敏度和高特异性,优于标准的定量实时PCR(qPCR)方法。这项工作为设计多功能纳米酶以及开发创新的基于CRISPR/Cas的双信号输出生物传感器用于检测病原体提供了新的见解。

结果与讨论

1. 纳米酶的制备及其酶动力学性能表征

首先,作者成功制备了具有POD样活性的hCG-血红素纳米花BFNzyme。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)结果表明,所合成的BFNzyme呈现明显的花状结构,直径在500-1000 nm范围。X射线光电子能谱(XPS)表明,BFNzyme含有Cu、Fe、C、N和O元素,证实了hCG和血红素的共存。接下来,我们评估了BFNzyme的POD样活性。动力学实验结果表明,BFNzyme表现出浓度依赖的POD样催化活性,当BFNzyme浓度为10 μg时,TMB的初始反应速率最高。通过绘制米氏-门田曲线并应用线性-伯克法分析,确定了BFNzyme的动力学参数,包括最大反应速率(Vmax)和米氏常数(KM)分别为371.9 μmol/L•min和0.158 mmol/L,显著优于天然HRP酶。这表明BFNzyme具有优异的催化性能,为后续CRISPR/Cas12a生物传感器的构建奠定了基础。

2. CRISPR/Cas12a双信号输出生物传感器的建立

基于BFNzyme的双功能特性,作者构建了一种基于LAMP扩增、CRISPR/Cas12a介导的核酸切割和BFNzyme介导的信号放大的双信号输出生物传感平台用于沙门氏菌的检测。在该平台中,ssDNA-BFNzyme通过生物素-链霉亲和素相互作用预先负载在MBs上作为报告探针。在目标存在的情况下,Cas12a蛋白激活其无特异性切割活性,切断ssDNA连接子,导致BFNzyme从MBs上释放。得益于BFNzyme的双功能性,释放的纳米酶不仅可用于比色信号放大,实现对目标的定量检测,还可与妊娠试纸条结合实现便携式现场检测。通过优化各实验参数,该双信号输出CRISPR/Cas12a生物传感器在沙门氏菌检测中表现出优异的分析性能。在比色检测模式下,该平台的检测限为1 cfu/mL,线性范围为10^1-10⁸ cfu/mL;在LFA条带检测模式下,检出限为10² cfu/mL,线性范围为10²-10⁸ cfu/mL。此外,该生物传感器在人工污染的湖水和牛奶样品中对沙门氏菌的检测也表现出良好的回收率。相比之下,采用qPCR方法对相同样品进行检测,其检测限为29 cfu/mL。这一结果表明,该CRISPR/Cas12a生物传感器在灵敏度、选择性和适用性等方面均优于标准的qPCR检测方法。

结论

综上所述,本研究成功制备了具有卓越POD样活性和hCG识别性的双功能性纳米花纳米酶BFNzyme,并将其应用于构建基于LAMP扩增、CRISPR/Cas12a核酸切割和BFNzyme信号放大的双信号输出生物传感器,实现对沙门氏菌的快速灵敏检测。该生物传感平台在比色和LFA条带检测模式下均表现出优异的分析性能,不仅在湖水和牛奶等实际样品中对沙门氏菌的检测效果显著,而且优于标准的qPCR方法。该工作为设计多功能纳米酶及开发创新的基于CRISPR/Cas的双信号输出生物传感器用于病原体检测提供了新思路,为实现快速、灵敏、便携的现场病原检测带来了新的可能性。

参考文献

Qiu, M.; Yuan, Z.; Li, N.; Yang, X.; Zhang, X.; Jiang, Y.; Zhao, Q.; Man, C., Self-assembled bifunctional nanoflower-enabled CRISPR/Cas biosensing platform for dual-readout detection of Salmonella enterica. J. Hazard. Mater. 2024, 471, 134323.