超光谱成像与深度学习用于芽孢杆菌孢子萌发的检测与定量

芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种革兰氏阳性、形成芽孢的杆状细菌，由于其根据温度、营养物质或压力等多种条件形成芽孢并萌发的能力，给食品工业带来了挑战。其孢子能够耐受低于100°C的加热处理，并且对多种食品级消毒剂和干燥具有抗性。虽然孢子是惰性的，不会导致食物中毒，但当外界条件变得有利时，孢子可以萌发为营养细胞，可能导致呕吐型或腹泻型食物中毒。呕吐型食物中毒是由于摄入了含有呕吐毒素——蜡样芽孢杆菌毒素的食物，导致呕吐、恶心、乏力，极少数情况下伴有腹泻。另一种食物中毒类型是由于摄入了带有芽孢杆菌的营养细胞/萌发的细胞，这些细胞在宿主的小肠内会产生三种类型的毒素。这三种腹泻型毒素是溶血素BL（Hbl）、非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒素K（CytK），可导致腹痛、水样腹泻，有时伴有恶心。因此，检测芽孢杆菌及其萌发和静止状态的表征对于评估关键风险以及采用合适的处理方案消除食品中的芽孢至关重要。

传统的微生物学方法在检测萌发方面非常高效和准确，但同样非常耗时且劳动密集。将超光谱成像（hyperspectral imaging, HSI）与机器学习相结合，是检测微生物及其他食品污染物的潜在技术。HSI与显微镜结合也已应用于区分芽孢大肠杆菌和芽孢杆菌在消毒后的活孢子和死孢子。研究表明，使用过氧化物杀死的芽孢的反射率高于活孢子和暴露于氯漂白剂的孢子。作者认为反射率与外衣和外孢子体的变化有关，他们假设过氧化物处理的孢子经历了可检测到的光谱变化，而这些变化在氯漂白剂处理的孢子中没有观察到，原因可能是氧化作用。最近，有研究表明HSI能够检测与细菌孢子及其生理状态。然而，HSI在孢子萌发检测中的作用尚未得到充分验证。

近日，新西兰农业研究中心食品信息学部门Marlon M. Reis团队在International Journal of Food Science and Technology期刊上发表了题为：Hyperspectral imaging and deep learning for detection and quantification of germination in Bacillus cereus spores的论文。

为了验证该问题，该研究假设孢子萌发过程中产生的变化会影响光与孢子的相互作用，而这种效应是可检测的，并且特异性地指示孢子的萌发。该研究中利用三种不同的萌发触发因素来诱导萌发途径，产生一系列萌发状态。此外，监测了萌发随时间的变化。该研究提供了关于HSI区分萌发和静止孢子的灵敏度的新数据。基于此开发一种强大且非侵入性的方法，不仅能够检测食品中的芽孢杆菌细胞，还能够确定它们是否已经萌发为营养细胞。

在该研究中，使用了L-丙氨酸、肌苷和亮氨酸等萌发物被受体识别，亚致死热激活（70-75°C，持续30 min）或中等压力（高达500MPa）三种不同的途径诱导样品萌发为营养形式并进行HSI分析。通过培养方法监测的萌发细胞数量（2 h后）发现，当使用热处理作为萌发诱导剂时，相较于热处理+L-丙氨酸（2.0±0.1 Log CFU/mL）和单独的L-丙氨酸（1.8±0.1 Log CFU/mL），初始的孢子悬浮液中萌发的细胞数量最高（p < 0.05）（2.5±0.1 Log CFU/mL）。图1显示，萌发诱导后，孵育时间对萌发的程度有正向但缓慢的影响。对于未经处理的孢子，2 h后的萌发数量仅为0.8 CFU/mL。所有用于光谱数据采集的平板在37°C下孵育24 h后，接种区域/点显示出菌落生长，证实存在活细胞。此外，粘蛋白作为对照样品没有显示出任何菌落生长，排除了任何污染的可能性。

图1 通过发芽细胞（黑条）和孢子数/SN（灰条）监测蜡状芽孢杆菌孢子的发芽情况，结果如下：（a）对照溶液/未处理（b）、用 L-丙氨酸作为发芽剂处理（c）通过热激活（d）热和发芽剂的组合。数据以平均值 S.D.（n = 9）表示。不共享字母的平均值有显著差异（p < 0.05）。

处理后的孢子样品（分别使用萌发物、热处理或两者结合）被加到三个空间分开的区域中，并手动对每个区域的图像进行分割。每个子组的平均光谱值被估算，并用于进一步分析。使用支持向量机（Support vector machine, SVM）构建分类模型，以区分对照组和处理组。平板“S1”、“S4”和“S5”的数据被用于校准，而平板“S2”和“S3”的数据被用于验证。在24 h后观察到的样品中，菌落形成明显，与其他处理组的样品相比，这些菌落显示出显著的差异，而这在模型中引入了偏差，导致了过于乐观的模型结果。因此，模型中仅使用了0、1和2 h的时间点（T0，T1，T2）的数据。对于SVM模型，参数C和sigma的最优值分别为sigma（0.01或log10=−2）和C（100或log10=2）。

图2中的符号颜色代表预测类别，符号类型则表示预测是否正确，其中实心符号表示正确，空心符号表示错误。如图所示，T0 9 S1这一对（位于面板的左上角）显示，左下角的点对应于G处理组。在该图中，30个点中只有4个点被错误分类（空心三角形）。在这种情况下，R处理组的点被错误分类为B处理组，在图7中这表现为第四列的第一行方块（从右至左）。T0的结果显示，G处理组的表现最好，这在T0面板的每个列中可以观察到。面板中的第二行自上而下对应于BL处理组，显示该组与其他类别之间几乎没有混淆，这对于假阴性水平（存在孢子但未检测到）非常重要。图2显示S1平板的错误分类水平最高，尤其是在Y组。这可能与S1平板中包含了所有的萌发处理有关，导致部分细胞处于萌发的早期或中期阶段，可能会由于其与静止孢子特征的相似性而被错误分类。正确分类率如图3所示。图4描述了各类样本之间的错误分类比例。T0中，G组的错误分类比例最低，主要被误分类为BL组和R组。所有其他类别的样本均被误分类为G组。BL组最容易被误分类到其他组，尤其是在T0中。此外，仅有少量B组样本被错误分类为BL组。

图2 预测每个区域中像素子组的分类。符号表示像素子组是否正确分类。每个符号的颜色对应于预测的处理：“B”表示休眠、未处理的孢子；“BL”表示不含细菌的阴性对照；“G”表示仅用发芽剂处理的孢子；“R”表示用热和发芽剂处理的孢子；“Y”表示仅用热处理的孢子。

图3 亚组水平的正确分类率。每个处理在每个时间点为每个平板正确分类的亚组的百分比如下：“B”表示休眠的、未处理的孢子；“BL”表示不含细菌的阴性对照；“G”表示仅用发芽剂处理的孢子；“R”表示用热和发芽剂处理的孢子；“Y”表示仅用热处理的孢子。

图4 类间误分类描述。每个类都有其在外环中定义的特征颜色。与类同色（外环颜色）的弦对应于该类在具有其他颜色的类中的误分类比例。（a）T0 的误分类，（b）T1 的误分类和（c）T2 的误分类。处理：‘“B”表示休眠、未处理的孢子；“BL”表示不含细菌的阴性对照；“G”表示仅用发芽剂处理的孢子；“R”表示 用热和发芽剂处理的孢子；“Y”表示仅用热处理的孢子。面板 (d–f) 根据类间误分类率提供类间重叠。

在该研究中，能够区分处理组（萌发/萌发中）与对照组（休眠/未处理的孢子），以及模拟孢子的结构对照组（BL）。这表明光谱信息确实能够捕捉不同类型颗粒之间的差异。同时，这也表明散射效应并不是区分颗粒的唯一因素，因为BL组的颗粒大小与孢子相似。然而，随着孵育时间的增加，假阴性数量，即预测为BL/粘蛋白但实际上含有孢子的处理组，有所增加，这表明孢子在脱离休眠状态但尚未完全萌发为营养细胞时，与模拟孢子结构的粘蛋白结构对照具有较高的相似性。

然而，要想在100%休眠状态下保持芽孢杆菌的孢子种群几乎是不可能的，除非将它们保持冷冻。因此，实验条件限制了分类模型的性能，因为无法仅使用完全休眠的孢子样品，这也导致了预期的错误分类。

综上所述，该研究报道了一种通过HSI捕获的光谱信息能够成功区分休眠孢子、萌发细胞以及模拟孢子大小的粘蛋白（结构对照）。不同萌发诱导过程对模型的预测性能产生了影响，表明萌发过程中不同阶段的变化也被检测到。该研究得出结论，孢子在萌发过程中发生的变化影响了光与孢子的相互作用，而这种效应是可检测并特异于孢子萌发过程的。因此，HSI可以用于检测食品中芽孢杆菌的存在及其休眠状态，未来的研究应验证这一观察结果，并开发一种能够评估芽孢杆菌休眠状态的检测方法。

论文来源：https://doi.org/10.1111/ijfs.17038