基于实时基因组测序技术的细菌耐药性预测

AMR是全球健康面临的十大威胁之一。临床上，因为当前的检测耐药细菌的周期较长，正确的治疗方案往往存在滞后性。由此，耐药性感染会导致更高的死亡率和发病率。因而，快速和准确地识别耐药的细菌性病原体至关重要。纳米孔测序设备轻巧便携，且具备实时分析的能力，是加速临床环境中病原鉴定及其耐药性分析的一大实用工具。不过，真正要将实时基因组学整合到临床实践中，尚需将其预测结果与已建立的诊断方法进行比较。尽管当前已有一些概念验证研究已致力于证明纳米孔测序在临床环境中快速诊断感染疾病的可行性，但是实时基因组学在检测临床相关耐药性是否优于现有的诊断方法方面仍处于“待证明”状态。基于此，Ela Sauerborn等人通过一个多重耐药的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)感染案例，展示了基于纳米孔测序技术的原位实时基因组学在临床环境进行AMR预测的能力。

具体地说，文中将来源于同一感染者不同用药阶段得到的细菌分离物作为研究对象。此感染者是一名免疫功能低下患者，临床给出的治疗方案如下：①初步使用美罗培南治疗；②治疗后临床确定感染病原为肺炎克雷伯菌，耐药表型显示美罗培南耐药，头孢他啶/阿维巴坦敏感，因而转向后者作为治疗方案；然而，在头孢他啶/阿维巴坦治疗下患者病情恶化。③从患者的阳性血液培养物中再次出现肺炎克雷伯菌分离物，并显示恢复体外美罗培南敏感性及头孢他啶/阿维巴坦耐药性，因而又转用美罗培南治疗，无果，病人死亡。感染细菌及其耐药表型通过临床建立的诊断方法获得（MALDI+VITEK+MIC试纸条）。作者将两个用药转变阶段（头孢他啶/阿维巴坦治疗前和治疗后）收集到的细菌分离物进行测序，两个细菌都测序了15小时，且第一个分离物再额外测序8小时，以模拟临床环境中适应性测序的潜力（图1）。测序结果显示，（1）正确地确定了治疗前和治疗后分离株中的肺炎克雷伯菌为感染病原；（2）针对第一个分离株，准确地检测到了40个拷贝的bla_KPC-2，证实了临床中观察到的美罗培南耐药性；（3）加测8 h后观察到bla_KPC-2拷贝数上升至147，bla_KPC-14拷贝数从原来的1上升至4（在加测2 h时，bla_KPC-14拷贝数上升至2），展现出了对2种抗生素的耐药性。当然这里也展示了本方法检测低丰度基因的能力；（4）针对第二个分离株，作者观察到bla_KPC-14拷贝数上升至44，而此基因已被界定为具有头孢他啶/阿维巴坦抗性的亚型之一。因而，基于实时基因组学的耐药性预测不仅与传统诊断方法确定的耐药性模式相一致，而且还确定了bla_KPC-14为假定的耐药机制。进一步，作者基于处理前后的测序数据，创建了一个完整的染色体和3个完整的圆形质粒的从头组装。cgMLST结果显示，两株菌株均为新出现的高危序列型ST147，但与全球已知的ST147基因组并不相同（50个等位基因阈值内未发现近亲）。通过与IncN质粒上检测到的最丰富的抗性基因（bla_TEM-4）进行归一化，发现在头孢他啶/阿维巴坦暴露处理后，bla_KPC-14的归一化丰度从0.56%增加到26.6%，由此进一步证明了bla_KPC-14为菌株的耐药机制。将耐药基因上传至NCBI，被界定为先前未被发现的KPC亚型，并命名为bla_KPC-159。不过，BLAST发现bla_KPC-159的核苷酸序列与bla_KPC-14为的相似性高达99%，因而作者将bla_KPC-159分类为bla_KPC-14。

基于这一系列的研究结果，作者表示肺炎克雷伯菌体外药敏结果的变化可能是由于涉及同一肺炎克雷伯菌谱系的复杂感染所致。在这个过程中，携带bla_KPC-14基因的IncN质粒原本含量较低，但在头孢他啶-阿维巴坦的作用下，由于进化上的选择优势而变得主导。因而，本研究方法可能揭示了临床表型方法未能检测到的头孢他啶/阿维巴坦的耐药性，或将影响治疗方案，挽救病人生命。总的来说，研究展示了实时基因组学在预测抗生素抗性方面的准确性，可以超越现有的临床实践。通过实时基因组学的应用，可以更好地定制治疗方案，减少不必要的抗生素使用，从而减缓抗性的发展，并改善患者的治疗效果。

图1 感染病例的病程和治疗方法概述

表1 基于实时基因组测序数据的两种细菌分离物的AMR预测结果

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49851-4