纳米花技术革新：新型电化学生物传感器精准锁定大肠杆菌

食源性病原体是食品安全的重要风险因素，导致全球显著的经济损失。大肠杆菌及其他食源性病原体主要通过食物链感染人类，导致腹泻、菌血症等症状。因此，开发简单、灵敏、特异、便携的食源性病原体检测技术可以防止其传播。传统的食源性病原体检测方法主要包括依赖培养的细胞计数和PCR检测。虽然这些检测技术具有灵敏性和特异性，但操作过程耗时、费力，分析成本高，仪器设备昂贵，且需要熟练的技术人员，因此难以在偏远和/或欠发达地区广泛应用。

多种新型检测技术已被开发并应用于食源性病原体的检测，包括电化学、荧光、化学发光和比色法。其中，电化学生物传感器平台因其高灵敏度、高选择性、操作简单、成本低廉、信号响应快速等优点，备受关注。然而，操作过程仍涉及复杂步骤，如样品引入、反复洗涤以及信号剂引入，限制了其广泛应用。

为了使电化学生物传感器检测更便携，需要简化操作步骤。近年来，电化学侧流免疫分析（electrochemical lateral flow immunoassay, eLFI）已与侧流免疫分析（lateral flow immunoassay, LFIA）和电化学信号读取相结合。通过将电化学反应的灵敏信号与单步、选择性和快速的侧流免疫分析相结合，eLFI克服了传统耗时步骤的限制，如样品引入、关键洗涤和信号剂引入。此外，eLFI还具有分析性能改进、操作简便和高选择性的优点。最后，eLFI易于与智能手机兼容的微电位计、嵌入式设备和便携式分析仪集成，促进了检测系统的小型化、自动化和智能化。

eLFI方法可用于分析多种目标。例如，通过在侧流装置中安装印刷电极并在电极上固定ACE2受体捕获SARS-CoV-2抗原，构建了一种用于检测SARS-CoV-2抗原的eLFI方法。同时，还开发了一种eLFI方法，用于通过集成侧流免疫分析和电化学读数检测钩端螺旋体，且在侧流检测区固定了多克隆抗LipL32初级抗体。此外，另一种带有电化学读数的侧流装置也被开发用于高灵敏度检测沙门氏菌，并在检测线上固定了抗沙门氏菌多克隆抗体。

花状有机-无机杂化纳米花是由无机组分（如金属磷酸盐）和抗体自组装而成的。纳米花可以增强抗体有机组分的活性和稳定性，且具有易于合成和优异生物相容性的特点，成为生物传感领域理想的应用材料。本研究中，基于大肠杆菌O157抗体为有机组分合成了有机-无机纳米花。这些有机组分可附着于eLFI检测线上，并作为信号探针。

近日，中国农业科学院长春兽医研究所Jiayu Wan团队在Microchimica Acta期刊上发表了题为：Hybrid nanoflower‑based electrochemical lateral flow immunoassay for Escherichia coli O157 detection论文。

为了解决该问题，本研究将印刷电极安装在侧流检测线下方，并且使用大肠杆菌O157特异性抗体作为有机组分制备的有机-无机纳米花附着在侧流检测线上。在存在大肠杆菌O157的情况下，形成了有机-无机纳米花-大肠杆菌O157抗菌肽标记的铁酚三明治结构。通过基于智能手机的设备，采用差分脉冲伏安法来监测检测线上的铁酚。

图1展示了该研究开发的检测方法原理。含有食源性病原体的检测样本通过样品垫接收并促进液体流动。随着样本流向结合垫，结合垫中的二茂铁标记抗菌肽（Ferrocene-labelled antimicrobial peptides, Fc-MI），形成免疫复合物。随后，液体继续流向测试区，预先沉积的大肠杆菌抗体纳米花捕获免疫复合物。任何未特异性结合的液体均被吸水垫吸收。样本流动10分钟后，使用差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry, DPV）在0.1至0.4 V的电位范围内检测铁酚甲酸。

图1 纳米材料合成示意图。B 电化学侧流免疫分析（eLFIA）测试条示意图。C eLFIA 测试条的制造

使用透射电子显微镜对抗体纳米颗粒进行了表征。图像显示了粒径均匀、形状一致的纳米材料，粒径范围为80-120 nm（见图2）。这反映了纳米结构的生长周期，通常在10至12 h之间。铜离子与MI抗菌肽配位，并与磷酸盐发生沉淀反应，导致铜磷酸盐晶核作为成核点的持续生长，最终形成花瓣状的纳米颗粒结构。

图2 大肠杆菌O157:H7抗体纳米花的表征。大肠杆菌抗体纳米复合材料的透射电子显微镜图像。比例尺表示纳米花的平均直径约为80-120 nm。

接下来，使用循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）和DPV对每个eLFIA制备过程进行了电化学表征。图3中的红线表示在没有目标细菌的测试条上检测到的信号，几乎没有信号。然而，当在样品垫上引入含有目标细菌的测试样本时，峰值显著增加，表明与没有目标细菌相比，存在明显差异。该观察结果证实了电子转移的成功实现。

图3 使用CV和DPV构建的生物传感器的电化学表征。不含大肠杆菌O157:H7（黑线）和含有大肠杆菌O157:H7（红线）的eLFIA的DPV和B CV曲线

在最佳条件下，使用DPV评估了不同浓度大肠杆菌O157的响应情况，以评估我们开发的检测策略的性能。图4显示了大肠杆菌O157浓度对数值（范围为1 × 10² CFU/mL到1 × 10⁸ CFU/mL）与相应电流强度变化之间的关系。回归方程为Y = 0.3158X − 0.4950 (R² = 0.9692)，表示X（大肠杆菌O157对数浓度）与Y（DPV峰值电流信号）之间的关系。根据公式LOD = 3σ/斜率计算检测限（LOD），其中σ代表空白信号组的标准偏差。结果表明，所开发的生物传感器适用于细菌的定量检测。实验中，纳米材料和Fc-MI通过孵育制备，省去了对共价修饰或复杂化学基团衍生化的需求。类似于适配体和其他材料，本实验中制备的纳米材料和Fc-MI显示了识别和捕获目标的能力。

纳米材料具有较大的比表面积，从而提高了载量效率和信号放大，进而实现了更高的灵敏度。同时，该方法简化了检测过程，并表现出六个数量级的较宽线性动态范围，以及优异的实时检测性能。

图4 添加大肠杆菌O157:H7后eLFIA试纸的代表性DPV。A 目前对不同浓度的大肠杆菌O157:H7的反应（10²- 10⁸ CFU/mL). B 电流与大肠杆菌O157:H7的对数浓度之间的关系（n=3）

开发的检测方法的特异性通过使用多种常见的食源性病原体进行了评估，包括大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、鳗弧菌和霍乱弧菌。图5显示了各种食源性病原体和PBS（阴性对照）在DPV检测中的峰值信号。与目标病原体大肠杆菌O157相比，非目标病原体和阴性对照组的信号值较低。因此，开发的检测方法具有高度的特异性，适合用于临床实时检测。

图5 通过比较添加目标物（大肠杆菌O157:H7）、大肠杆菌、Sal（沙门氏菌）、Sta（金黄色葡萄球菌）、Lis（单核细胞增生李斯特菌）、V.P（副溶血性弧菌）、V.A（鳗弧菌）、V.C（霍乱弧菌）和对照（每种细菌10⁸ CFU/mL）后DPV峰值电流响应来评估所开发的检测方法的特异性。

为了评估所开发的分析方法在实际样本中的应用，我们在消毒的纯牛奶样本中引入了大肠杆菌O157，浓度范围为10⁴ CFU/mL到10⁶ CFU/mL。首先，我们对牛奶样本进行1:10的稀释，以减轻基质效应对检测过程的阻碍。在完成准备阶段后，我们对样本进行了测试。结果显示，回收率在103.46%至111.96%之间，且相对标准偏差在2.06%至3.45%之间（见表1）。这些结果表明，所开发的生物传感器具有优异的重复性，适合实际样本分析。

表1 检测加标牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7

综上所述，本研究将侧流免疫分析与电化学读取相结合，用于检测大肠杆菌O157，并使用大肠杆菌抗体作为有机组分，合成了有机-无机纳米花，这些纳米花附着在检测线上，用于捕获目标物和信号探针。通过集成无线设备和智能手机读取电信号，使得该生物传感器便携，适合现场测试。令人感兴趣的是，所开发的生物传感器检测限为25 CFU/mL，线性动态范围为10² CFU/mL至10⁸ CFU/mL。与其他已报道的细菌检测方法相比，本次研究所设计的检测方案在检测限方面具有显著优势。此外，生物传感器已成功应用于实际食品样本中。通过更换抗体，该生物传感器平台可以扩展用于检测其他食源性病原体。

论文来源：https://doi.org/10.1007/s00604-024-06513-y