利用高化学发光催化性能的钴DNA-无机杂化结构对多种真菌毒素进行超灵敏分析

由于微量真菌毒素的协同危害以及缺乏敏感且用户友好的检测方法，迫切需要对食品和药品中的真菌毒素进行多重检测，这一任务具有很大挑战。近年来，各种生物传感器和生物测定方法被开发用于快速、灵敏地检测有害物质，其中化学发光（CL）免疫分析法具有特异性、不需要外界光源、无散射光干扰、设备简单等优点，适用于真菌毒素的检测。

经典的CL免疫分析法使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体催化鲁米诺和过氧化氢产生相对强烈的CL。然而，一个抗体只能负载2- 3个HRP分子，导致灵敏度不足，测定低丰富的目标。此外，由于标记过程复杂，可能导致HRP失活。

本研究通过等温滚环扩增（RCA）建立了钴DNA -无机杂化超结构（Co@DS）用于多种真菌毒素的超灵敏化学发光（CL）成像分析。DNA-无机杂化超结构（DS）是通过RCA产生的复合材料，其中富集钴离子，以模拟HRP的功能，使Co@DS具有较高的CL催化性能。如图1A所示，利用phi29 DNA聚合酶、环状DNA模板和脱氧核糖核苷酸，然后加入Co²⁺溶液，通过RCA反应制备Co@DS。制备的Co@DS含有可与生物素化DNA杂交的重复序列。功能Co@DS具有以下显著优势：1）在简单温和的混合过程中，Co²⁺可以自动与DS结合，避免了复杂的组装过程，省去了繁琐的HRP标记。2）DS利用了RCA强大的扩增能力，可以负载丰富的Co²⁺，导致高灵敏度。3）基于竞争性免疫分析和生物素-亲和素识别，可作为多种真菌毒素定量的通用平台。Co@DS 与生物素化 DNA 相结合，成为一个通用平台，并与一次性免疫传感器阵列芯片相结合。经过竞争性免疫测定和生物素-亲和素识别，Co@DS催化的鲁米诺和过氧化氢的CL信号在阵列芯片的每个检测区同时成像。目标霉菌毒素可通过 CL 强度进行量化。如图1B所示，免疫传感器阵列分别用BSA修饰的三种真菌毒素固定在第1、2和3行。BSA修饰的真菌毒素可以与分析物中的三种毒素（黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A）竞争结合相应的单克隆抗体。在T线上捕获的生物素-IGg、亲和素和功能Co@DS的量随着目标霉菌毒素浓度的增加而下降。如图1C所示，在多达15个样品的平行孵育后，同时对所有T线的CL点进行成像。三种毒素浓度与CL强度呈负相关。该方法具有高灵敏度、高选择性、高通量、易操作等特点。

图1 （A）功能性Co@DS的制备过程；（B）化学发光免疫检测过程；（C）三种真菌毒素的化学发光成像分析。

研究要点及结果：

（1）Co@DS及生物素化DNA功能化Co@DS的制备及表征。Co²⁺与磷酸盐骨架之间的静电相互作用以及Co²⁺与磷酸盐和碱性基团之间通过Co-O键的配位相互作用导致Co@DS的形成。

（2）Co@DS的化学发光催化能力及机制研究。结果表明制备的Co@DS展现出优异的过氧化物酶样活性。得益于钴离子的高负载量，它能够有效催化鲁米诺与过氧化氢的反应，从而产生强烈的CL信号。

（3）检测方法可行性验证及实验条件优化。目标霉菌毒素的存在会阻碍相应的抗体、生物素标记的IgG、链霉亲和素以及功能化Co@DS与霉菌毒素-BSA修饰的阵列芯片的结合，从而产生与目标霉菌毒素浓度负相关的CL信号。

（4）使用化学发光成像进行三种真菌毒素联合检测的性能验证。结果表明，一个阵列可在99分钟内同时进行45个样品的测试，三种真菌毒素（黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮）对应的检出限分别为0.75、0.62和0.61 pg/mL，与以往的方法相比均处于较低水平。鉴于功能化Co@DS可以很容易地通过生物素对亲和素的特异性识别与免疫复合物连接，对于多种分析物的检测，无需合成用HRP或其他纳米酶标记的每种分析物对应的特异性抗体。方法具有良好的选择性、稳定性及重复性。

（5）实际样品中真菌毒素的检测。结果表明薏苡仁对CL免疫测定的基质效应可以忽略不计，从而肯定了该方法的准确性和在实际样品中的应用潜力。

研究结论

总的来说，本研究采用简便的等温RCA反应合成了钴- DNA -无机杂化结构。所制备的Co@DS具有高的过氧化物酶样活性，由于钴离子的高负载数量，可以催化发鲁米诺和过氧化氢获得强烈的CL释放。通过整合生物素化DNA, Co@DS被赋予亲和素的亲和力，可扩展到传感器阵列上通过竞争免疫法进行多种真菌毒素的免疫测定。该方法易于操作，线性范围宽，灵敏度和检测通量高，选择性、稳定性和重复性好。薏苡仁样品中真菌毒素的CL显像分析结果与液相色谱-质谱分析结果一致。它为食品和药品中的多霉菌毒素监测提供了一种简单、快速、超灵敏和准确的方法，以保护人类免受潜在的健康风险。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02934